Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen
Summary
Makrophagen-phagozytische Aktivität gegen Krebszellen, insbesondere 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zellen, wurde in dieser Studie abgebildet. Das Modell der Kokultur von Lebenden Zellen wurde mit einer Kombination aus fluoreszierender und differentialer Interferenzkontrastmikroskopie erstellt und beobachtet. Diese Bewertung wurde mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware zur Entwicklung von Multipoint-Zeitraffervideos abget/die sich erstellt haben.
Abstract
Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) wurden als wichtiger Bestandteil für Tumorwachstum, Invasion, Metastasierung und Resistenz gegen Krebstherapien identifiziert. Tumorassoziierte Makrophagen können jedoch je nach Tumormikroumgebung schädlich für den Tumor sein und ihre phänotypischen Eigenschaften reversibel verändern, indem sie entweder die zytotoxische Aktivität von Immunzellen antagonisieren oder die Anti-Tumor-Reaktion verbessern. Die molekularen Aktionen von Makrophagen und ihre Wechselwirkungen mit Tumorzellen (z.B. Phagozytose) wurden nicht umfassend untersucht. Daher steht die Interaktion zwischen Immunzellen (M1/M2-Subtyp TAM) und Krebszellen in der Tumormikroumgebung heute im Fokus der Krebsimmuntherapieforschung. In der vorliegenden Studie wurde ein Live-Zell-Kokulturmodell von induzierten M1-Makrophagen und Maus-Mamma-4T1-Karzinomzellen entwickelt, um die phagozytische Aktivität von Makrophagen mithilfe einer Zeitraffer-Videofunktion mithilfe von Phasenkontrast-, Fluoreszenz- und Differentialinterferenzkontrast(DIC)-Mikroskopie zu bewerten. Die vorliegende Methode kann die Mehrpunkt-Livezellbildgebung der Phagozytose beobachten und dokumentieren. Die Phagozytose von 4T1-Zellen durch M1-Makrophagen kann mittels fluoreszierender Mikroskopie beobachtet werden, bevor 4T1-Zellen mit Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) gefärbt werden. Die aktuelle Publikation beschreibt, wie Makrophagen und Tumorzellen in einer einzigen bildgebenden Schale kokultiviert werden, M1-Makrophagen polarisieren und Multipoint-Ereignisse von Makrophagen aufzeichnen, die 4T1-Zellen während 13 h Cokultur verschlingen.
Introduction
Makrophagen sind die erste Linie der Immunabwehr und spielen eine Rolle bei der Orchestrierung von Immunreaktionen gegen Krankheitserreger und Fremdstoffe, einschließlich Krebszellen. Sie sind eine spezialisierte Phagozyte, die unerwünschte Partikel im Körper zerstört und loswird. Makrophagen tragen zu Abwehrfunktionen wie der Clearance von apoptotischen Zellen und Mikroorganismen und der Rekrutierung anderer Immunzellenbei 1. Makrophagen können sich als Reaktion auf Umweltsignale2in zwei verschiedene Typen unterscheiden, M1- und M2-Makrophagen. M1-polarisierte Makrophagen (d.h. klassisch aktivierte Makrophagen) werden durch die Zytokininterferon-Interferon– (IFN-) und Lipopolysaccharide (LPS) aktiviert und sind an der Entzündungsreaktion, der Pathogenclearance, der effizienten Phagozytose und der tumorzidenden Immunität3,4beteiligt. Die M2-Makrophagen sind eng mit tumorassoziierten Makrophagen (TAMs) verwandt und haben entzündungshemmende und Tumorfördereigenschaften4.
Phagozytose, abgeleitet aus dem Altgriechischen (Phagein), was “zu verschlingen” (kytos), was “Zelle” und -osis bedeutet, was “Prozess”bedeutet 5. Phagozytose ist ein Rezeptor-vermittelter Prozess, bei dem Phagozyten (einschließlich Makrophagen, Monozyten und Neutrophilen) eindringende Krankheitserreger töten und verschlingen, FremdeTeilchen säubern und apoptotische Zellablagerungen beseitigen. Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) sind im Stroma in verschiedenen Tumoren, einschließlich Brustkrebs, gefunden und haben Pro-Tumor-Funktionen6,7, was zu einer Resistenz gegen Phagozytose führt. Der detaillierte Mechanismus der Tumorzellphagozytose durch Makrophagen ist noch nicht verstanden.
Diese Studie stellt eine zweistufige Methode vor: 1) 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen und M1-polarisierte Makrophagen werden kokultiviert, und 2) die phagozytische Aktivität der Makrophagen wird mittels Live-Zell-Videomikroskopie bewertet. CFSE-Fluoreszenzfarbstoff wurde verwendet, um die 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen zu färben. Der Fleck kennzeichnet 4T1-Zellen, um sie von den kokultivierten M1-Makrophagen in einer einzigen bildgebenden Schale zu unterscheiden. RAW 264.7 Makrophagen werden mit LPS und IFN-A zu einem M1-Phänotyp polarisiert. Um eine vollständige Polarisation zu gewährleisten, wurde eine Immunfärbung mit anti-iNOS-Antikörpern durchgeführt, die mit FITC konjugiert sind. Anschließend wurde eine Multipoint-Serie von Zeitrafferbildern angeschafft, um mehrere Ereignisse, einschließlich Phagozytose, innerhalb der Kokultur zu beobachten.
Ein besseres Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Makrophagen kann zu einer potenziellen Krebsimmuntherapie führen. Die Live-Zell-Bildgebung bietet eine detaillierte Ansicht der zellulären Dynamik in Echtzeit und wurde verwendet, um Zellmigration, phäkotypisches Screening, Apoptose und Zytotoxizität8,9 in der Neurowissenschaft, Entwicklungsbiologie und Arzneimittelentdeckung zu untersuchen. Obwohl der vorgeschlagene Tumor in dieser Studie Brustkrebs ist, kann die Methode auch auf mehrere Zielzellen und verschiedene Effektorzellen angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll erfordert zwei Schritte: 1) Kokultur von 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen und M1-polarisierten Makrophagen und 2) Bewertung der phagozytischen Makrophagenaktivität mittels Zeitraffermikroskopie. Live-Zell-Kokultur ist weit verbreitet in Phagozytose und Migration Assays verwendet. Das Live-Zell-Kokulturmodell ist hier ein einfaches, anpassungsfähiges In-vitro-Verfahren (Abbildung 2), das einen fluoreszierenden Farbstoff CFSE verwendet, der zur Kennzeichnung der 4T1-Zi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800 finanziert. Wir danken dem Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) Laboratorien und Mikroskopie-Bildgebungsanlage. Besonderer Dank geht an Mohd Daniel Hazim für die Hilfe bei der Bearbeitung und Aufnahme des experimentellen Videos für diese Arbeit.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
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