Isolatie en differentiatie van primaire Myoblasten van muis skeletspieren Explants

Summary

Myoblasten zijn prolifererende precursor cellen die differentiëren om polynucleated myotubes en uiteindelijk skeletspieren myofibers vormen. Hier presenteren we een protocol voor efficiënte isolatie en cultuur van primaire myoblasten van jonge volwassen muis skeletspieren. De methode maakt moleculaire, genetische, en metabole studies van spiercellen in de cultuur.

Abstract

Primaire myoblasten zijn niet-gedifferentieerde prolifererende precursoren van skeletspieren. Ze kunnen worden gekweekt en bestudeerd als spier precursoren of geïnduceerd om te differentiëren in latere stadia van spierontwikkeling. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een robuuste methode voor de isolatie en cultuur van een zeer proliferatieve populatie van Myoblast cellen van jonge volwassen muis skeletspieren explanten. Deze cellen zijn nuttig voor de studie van de metabolische eigenschappen van de skeletspieren van verschillende muismodellen, evenals in andere downstream toepassingen zoals transfectie met exogene DNA of transductie met virale expressie vectoren. Het niveau van differentiatie en metabole Profiel van deze cellen is afhankelijk van de lengte van de blootstelling, en de samenstelling van de media die worden gebruikt voor het opwekken van Myoblast differentiatie. Deze methoden bieden een robuust systeem voor de studie van muis spiercellen metabolisme ex vivo. Belangrijk is dat, in tegenstelling tot in vivo-modellen, de hier beschreven methoden zorgen voor een celpopulatie die kan worden uitgebreid en bestudeerd met hoge reproduceerbaarheids niveaus.

Introduction

Hoewel vaak aangehaald als een indicatie van de algehele metabole gezondheid, meerdere studies hebben aangetoond dat body mass index (BMI) bij oudere volwassenen is niet consistent geassocieerd met een hoger risico van sterfte. Tot op heden is de enige factor die consistent is met verminderde sterfte in deze populatie toegenomen spier massa¹. Spierweefsel vertegenwoordigt een van de grootste bronnen van insuline-gevoelige cellen in het lichaam, en is daarom kritisch in het onderhoud van de totale metabole homeostase². Activering van skeletspier weefsel via oefening wordt geassocieerd met stijgingen van zowel de lokale insulinegevoeligheid en de algehele metabole gezondheid³. Terwijl in vivo modellen zijn essentieel voor het bestuderen van de spier fysiologie en de impact van de spierfunctie op geïntegreerde metabolisme, primaire culturen van myotubes bieden een Tractable systeem dat de complexiteit van dierproeven vermindert.

Myoblasten afgeleid van postnatale spieren kunnen worden gebruikt om de impact van talrijke behandelings-en groeicondities op een zeer reproduceerbare manier te bestuderen. Dit is al lang erkend en verschillende methoden voor Myoblast isolatie en cultuur zijn beschreven^4,5,6,7,8,9. Sommige van deze methoden gebruiken neonatale spieren en leveren relatief lage aantallen myoblasten op,^5,8, waarvoor meerdere dieren nodig zijn voor grootschalig onderzoek. Ook de meest gebruikte methoden voor het kweken van myoblasten gebruiken “pre-plating” om te verrijken voor myoblasten, die minder hecht zijn dan andere celtypen. We hebben geconstateerd dat de alternatieve verrijkings methode die hier wordt beschreven veel efficiënter en reproduceerbaar is voor het verrijken van een zeer proliferatieve Myoblast populatie. Samengevat, dit protocol maakt de isolatie van zeer proliferatieve myoblasten van jonge volwassen spier Explants, via uitgroei in cultuur media. Myoblasten kunnen herhaaldelijk worden geoogst, gedurende meerdere dagen, snel uitgebreid, en geïnduceerd om te differentiëren in myotubes. Dit protocol reproduceerd genereert een groot aantal gezonde Myoblast cellen die krachtig differentiëren in spontaan trekkingen myotubes. Het heeft ons in staat om metabolisme en circadiane ritmes te bestuderen in primaire myotubes van muizen van een verscheidenheid van genotypes. Tot slot, we omvatten methoden voor de voorbereiding van myotubes voor de studie van oxidatieve metabolisme, met behulp van metingen van de zuurstofverbruik in 96-goed platen.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van Scripps onderzoek. 1. inzameling en verwerking van spierweefsel Explants De dag voorafgaand aan de sectie, Steriliseer alle dissectie apparatuur (Tang, scheermesjes en schaar) en bereid alle benodigde media: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), MB plating media (12,5 mL DMEM, 12,5 mL hammen F12, 20 mL van warmte-geïnactiveerde foetale runderen serum (FBS), 5 mL amniotische vloeistof medium supplement), en coating oplossing…

Representative Results

In de volgende sectie 1 van het opgegeven protocol moeten primaire cellen worden bereikt die uit de explantaten komen die zichtbaar zullen zijn onder een standaard lichtmicroscoop (Figuur 2). Er zal een heterogene celpopulatie worden gezien die groeit uit en rond elke spierweefsel explant. Myoblasten zullen verschijnen als kleine, ronde, heldere bollen. Na deel 2 van het Protocol zullen vroege oogsten van myoblasten uit weefsel Explants opleveren, die weinig …

Discussion

Skeletspieren is van vitaal belang voor de oprichting en het onderhoud van metabole homeostase¹¹. De studie van spier fysiologie is gecompliceerd door interindividuele variabiliteit, evenals moeilijkheden bij het verkrijgen van monsters, met name in het geval van menselijke studies. Gekweekte primaire myotubes is aangetoond dat het even vele kenmerken van spier fysiologie, met inbegrip van calcium homeostase¹², regeneratie van beschadigde spierweefsel^5</su…

Materials

Coating Solution:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Collagen	Life Technologies	A1064401	1.7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Plating Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Differentiation Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Heat Inactivated Horse Serum	Sigma	H1138	1.5 mL
Insulin-Selenium-Transferrin	Life Technologies	41400045	0.5 mL
Other Materials:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicin	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells
Forceps	Any
Razor Blades	Any
Scissors	Any
Whatman paper	VWR	21427-648
60 mm plate	VWR	734-2318
10 cm plate	VWR	25382-428 (CS)
T25 Flasks	ThermoFisher	156367
T75 Flasks	ThermoFisher	156499
Centrifuge Tubes (15mL)	BioPioneer	CNT-15
Oxygen Consumption Rates:
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	Seahorse XFe96 Analyzer	Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96-well plates for use in XFe96 Analyzer
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate	Agilent	102720-100	components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Palmitic acid	Sigma	P5585-10G	for measurement of fatty acid oxidation
carnitine	Sigma	C0283-5G	for measurement of fatty acid oxidation
Etomoxir	Sigma	E1905	for measurement of fatty acid oxidation
BSA	Sigma	A7030	used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation