מיאוברוב הם מתרבים תאים מקודכי להבדיל לטופס מיונוקלאוטים מיופולימרים ובסופו של דבר שריר השלד סיבים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד יעיל והתרבות של myoblasts חזיקה הראשוני של השרירים העכבר המבוגר הצעיר. השיטה מאפשרת מחקרים מולקולריים, גנטיים ומטבוליים של תאי שריר בתרבות.
Myoblasts נמשך ראשוני הם מובחן מתרבים מקדם של שריר השלד. הם יכולים להיות מתורבתים ולמדו כלפי מקדם שרירים או המושרה להבדיל בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח שרירים. הפרוטוקול המסופק כאן מתאר שיטה איתנה עבור הבידוד והתרבות של אוכלוסיה מתרבים מאוד של תאים myoblast חוז מפני השלד הצעיר למבוגרים שרירים בשרירים. תאים אלה שימושיים למחקר של מאפייני חילוף החומרים של שריר השלד של דגמי עכבר שונים, כמו גם ביישומים אחרים במורד הזרם כגון העברה עם DNA אקסוגני או התמרה עם וקטורים ביטוי ויראלי. רמת הבידול ופרופיל חילוף החומרים של תאים אלה תלויה באורך החשיפה, והרכב של המדיה המשמש כדי לגרום בידול myאובאלי. שיטות אלה לספק מערכת חזקה לחקר של תא שרירי העכבר מטבוליזם לשעבר vivo. חשוב לציין, בניגוד לדגמים vivo, השיטות המתוארות כאן מספקות אוכלוסיית תאים שניתן להרחיב וללמוד ברמות גבוהות של האפשרות הניתנת למחקר.
בעוד מצוטט לעתים קרובות כאינדיקציה לבריאות מטבולית כוללת, מחקרים מרובים הראו כי מדד מסת הגוף (BMI) אצל מבוגרים לא קשורה בעקביות עם סיכון גבוה יותר של תמותה. עד כה, הגורם היחיד המוצג להיות עקבי עם תמותה מופחתת באוכלוסייה זו הוא מוגבר מסת השריר1. רקמת השריר מייצגת את אחד המקורות הגדולים ביותר של תאים רגישים לאינסולין בגוף, ולכן הוא קריטי בתחזוקת הומאוסטזיס הכולל מטבולית2. הפעלה של רקמת שריר השלד באמצעות פעילות גופנית קשורה מגדילה הן רגישות מקומית אינסולין הכולל בריאות מטבולית3. בעוד במודלים vivo חיוניים לחקר הפיזיולוגיה שרירים ההשפעה של תפקוד שרירים על חילוף החומרים משולב, התרבויות הראשיות של מיוכי מספקים מערכת צייתן המפחית את המורכבות של מחקרים בעלי חיים.
מוביאוטיבי נגזר השרירים שלאחר לידה ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעה של הטיפול בתנאים רבים והצמיחה באופן מאוד מיוניתן. זה כבר מזמן הוכרה ומספר שיטות לבידוד myoblast חוז ותרבות תוארו4,5,6,7,8,9. חלק מהשיטות הללו משתמשות בשרירי הילדים ומפיקות מספר נמוך יחסית של myoblasts חזיק5,8, המחייב כמה בעלי חיים למחקרים בקנה מידה גדול יותר. כמו כן, השיטות הנפוצות ביותר לשימוש בשיטת “ציפוי מקדים” להעשרת עבור myoblasts אשר הם פחות חסיד מאשר סוגי תאים אחרים. מצאנו את שיטת ההעשרה החלופית המתוארת כאן כדי להיות הרבה יותר יעילה ומיושבה להעשרת אוכלוסיית מחוז מאוד מתרבים. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר את הבידוד של myoblasts צמיחה מאוד מתרבים מפני השרירים הצעירים explants בוגרים, באמצעות צמיחה לתוך מדיה התרבות. ניתן לקצור את המכשולים שוב ושוב, במשך מספר ימים, להרחיב במהירות, והמושרה כדי להבדיל לתוך שפופרות. פרוטוקול זה מייצר מספר רב של תאי מחוז מיאובלי בריאים אשר מבדילים באופן ספונטני מיופופרות. הוא איפשר לנו ללמוד חילוף החומרים ומקצבים מעגליות ב מיוכי הראשי של עכברים של מגוון של גנוסוגים. לבסוף, אנו כוללים שיטות להכנת מיוצינורות לחקר מטבוליזם חמצוני, באמצעות מדידות של שיעורי צריכת החמצן ב 96-לוחיות.
שריר השלד חיוני להקמת ותחזוקה של הומאוסטזיס מטבולית11. המחקר של הפיזיולוגיה שרירים הוא מסובך על ידי השונות הבינאישית, כמו גם קושי להשיג דגימות, במיוחד במקרה של מחקרים אנושיים. מיולים הראשי מתורבת הוכחו לכידה של תכונות רבות של פיזיולוגיה שרירים, כולל סידן הומאוסטזיס12…
The authors have nothing to disclose.
המחברים אסירי תודה ד ר מתיו וואט באוניברסיטת מלבורן וד ר אנסטסיה קראלי באוניברסיטת ג’ונס הופקינס לסיוע אימוץ פרוטוקול זה מבוסס על העבודה של מומבל ואח ‘6. אנו גם מודים לד ר סבין ג’ורדן על סיוע בפיתוח ואימוץ הפרוטוקול הזה במעבדה שלנו. עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי לבריאות R01s DK097164 ו DK112927 כדי K.A.L.
Coating Solution: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
Plating Media: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
Myoblast Media: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
Differentiation Media: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
Other Materials: | |||
PBS | Gibco | 14040133 | |
Gentamicin | Sigma | G1397 | |
TrypLE | Gibco | 12604013 | |
DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
Forceps | Any | ||
Razor Blades | Any | ||
Scissors | Any | ||
Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
Oxygen Consumption Rates: | |||
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |