Greffe tissulaire pour la reconstruction oesophagielle circonférence chez les rats
Summary
La reconstruction oesophagienne est une procédure difficile, et le développement d’un oesophage tissulaire qui permet la régénération de la muqueuse et du muscle oesophagiens et qui peut être implanté comme une greffe artificielle est nécessaire. Ici, nous présentons notre protocole pour générer un oesophage artificiel, y compris la fabrication d’échafaudages, la culture de bioréacteurs, et diverses techniques chirurgicales.
Abstract
L’utilisation de matériaux biocompatibles pour la reconstruction oesophagienne circonférence est une tâche techniquement difficile chez les rats et nécessite une technique d’implant optimale avec un soutien nutritionnel. Récemment, il y a eu beaucoup de tentatives à l’ingénierie oesophagielle de tissu, mais le taux de succès a été limité en raison de la difficulté dans l’épithélisation tôt dans l’environnement spécial du péristaltisme. Ici, nous avons développé un oesophage artificiel qui peut améliorer la régénération de la muqueuse oesophagienne et des couches musculaires à travers un échafaudage tubulaire à deux couches, un système de bioréacteur à base de cellules souches mésenchymales, et une technique d’alimentation de dérivation avec modifié Gastrostomy. L’échafaudage est fait de nanofibres de polyuréthane (PU) en forme cylindrique avec un brin de polycaprolactone imprimé en trois dimensions (3D) enroulé autour de la paroi extérieure. Avant la transplantation, les cellules souches mésenchymales d’origine humaine ont été ensemiées dans le lumen de l’échafaudage, et la culture de bioréacteur a été exécutée pour augmenter la réactivité cellulaire. Nous avons amélioré le taux de survie de greffe en appliquant l’anastomose chirurgicale et couvrant la prothèse implantée avec un aileron de glande thyroïde, suivi de l’alimentation nonorale temporaire de gastrostomy. Ces greffes ont pu récapituler les résultats de l’épithélialization initial et de la régénération de muscle autour des emplacements implantés, comme démontré par l’analyse histologique. En outre, des fibres d’élastine accrues et la néovascularisation ont été observées dans la périphérie de la greffe. Par conséquent, ce modèle présente une nouvelle technique potentielle pour la reconstruction oesophagielle cirférent.
Introduction
Le traitement des désordres oesophagiens, tels que les malformations congénitales et les carcinomes oesophagiens, peut mener à la perte structurale de segment de l’oesophage. Dans la plupart des cas, des greffes de remplacement autologues, telles que des conduits gastriques ou des interpositions du côlon, ont été effectuées1,2. Cependant, ces remplacements oesophagiens ont une variété de complications chirurgicales et de risques de réopération3. Ainsi, l’utilisation d’échafaudages d’œsophage tissulaires imitant l’œsophage indigène peut être une stratégie alternative prometteuse pour finalement régénérer les tissus perdus4,5,6.
Bien qu’un oesophage tissulaire offre potentiellement une alternative aux traitements actuels des défauts oesophagiens, il existe des barrières importantes pour son application in vivo. La fuite anastomotique postopératoire et la nécrose de l’échafaudage oesophagique implanté mènent inévitablement à une infection mortelle de l’espace aseptique environnant, tel que le mediastinum7. Par conséquent, il est extrêmement important de prévenir la contamination des aliments ou de la salive dans la plaie et le tube nasogastrique. La gastrostomie ou la nutrition intraveineuse devrait être envisagée jusqu’à ce que la cicatrisation primaire des plaies soit terminée. À ce jour, l’ingénierie des tissus oesophagiens a été réalisée dans de grands modèles animaux parce que les grands animaux ne peuvent être nourris que par hyperalimentation intraveineuse pendant 2-4 semaines après l’implantation de l’échafaudage8. Cependant, un tel modèle d’alimentation non orale n’a pas été établi pour la survie tôt après la transplantation oesophagienne chez de petits animaux. C’est parce que les animaux étaient extrêmement actifs et incontrôlables, de sorte qu’ils ne pouvaient pas garder le tube d’alimentation dans leur estomac pendant une longue période de temps. Pour cette raison, il y a eu peu de cas de transplantation oesophagique réussie chez de petits animaux.
Compte tenu des circonstances de l’ingénierie des tissus oesophagiens, nous avons conçu un échafaudage tubulaire à deux couches composé de nanofibres électrospun (couche intérieure; Figure 1A) et un brin imprimé en 3D (couche extérieure; Figure 1B) incluant une technique de gastrostomie modifiée. La nanofibre interne est faite de PU, un polymère non dégradable, et empêche les fuites de nourriture et de salive. Les brins imprimés 3D externes sont faits de polycaprolactone biodégradable (PCL), qui peut fournir une flexibilité mécanique et s’adapter au mouvement péristaltique. Des cellules souches mésenchymales dérivées de l’adipose humaine (HAD-MSCs) ont été ensemiées sur la couche interne de l’échafaudage pour favoriser la réépithhéliarisation. La structure nanofibre peut faciliter la régénération muqueuse initiale en fournissant un environnement structurel de matrice extracellulaire (ECM) pour la migration cellulaire.
Nous avons également augmenté le taux de survie et la bioactivité des cellules inoculées grâce à la culture de bioréacteurs. L’échafaudage implanté a été recouvert d’un rabat de glande thyroïde pour permettre une régénération plus stable de la muqueuse oesophagienne et de la couche musculaire. Dans ce rapport, nous décrivons des protocoles pour des techniques d’ingénierie de tissu oesophagées, y compris la fabrication d’échafaudages, la culture de bioréacteur sénchymal à base de cellules souches, une technique d’alimentation de dérivation avec gastrostomy modifié, et une chirurgie modifiée technique d’anastomosis pour la reconstruction oesophagienne circonféide dans un modèle de rat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les études animales existantes sur l’oesophagi artificiel sont encore limitées par plusieurs facteurs critiques. L’échafaudage oesophagique artificiel idéal doit être biocompatible et avoir d’excellentes propriétés physiques. Il devrait pouvoir régénérer l’épithélium muqueux dans la période postopératoire tôt pour empêcher la fuite anastomotique. La régénération des couches musculaires longitudinales circulaires et externes est également importante pour le péristaltisme fonctionnel<sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par le Projet de recherche et développement des technologies de la santé de la Corée par l’intermédiaire du Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), financé par le Ministère de la santé et du bien-être social, République de Corée (numéro de subvention : HI16C0362) et Basic Science Research Programme par l’intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financé par le Ministère de l’éducation (2017R1C1B2011132). Les biospécimens et les données utilisées dans cette étude ont été fournis par la Biobank of Seoul National University Hospital, membre du Korea Biobank Network.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
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