Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats
Summary
Die Ösophagusrekonstruktion ist ein anspruchsvolles Verfahren, und die Entwicklung einer gewebekonstruierten Speiseröhre, die die Regeneration von Speiseröhrenschleimhaut und Muskel ermöglicht und die als künstliches Transplantat implantiert werden kann, ist notwendig. Hier stellen wir unser Protokoll zur Erzeugung einer künstlichen Speiseröhre vor, einschließlich Gerüstherstellung, Bioreaktoranbau und verschiedenen chirurgischen Techniken.
Abstract
Die Verwendung biokompatibler Materialien für die umlaufende Ösophaver Rekonstruktion ist eine technisch anspruchsvolle Aufgabe bei Ratten und erfordert eine optimale Implantattechnik mit Ernährungsunterstützung. In letzter Zeit gab es viele Versuche der Ösophakengewebe-Engineering, aber die Erfolgsrate wurde aufgrund von Schwierigkeiten bei der frühen Epithelisierung in der speziellen Umgebung der Peristaltik begrenzt. Hier haben wir eine künstliche Speiseröhre entwickelt, die die Regeneration der Speiseröhrenschleimhaut und der Muskelschichten durch ein zweilagiges Röhrengerüst, ein mesenchymales Stammzell-basiertes Bioreaktorsystem und eine Bypass-Fütterungstechnik mit modifizierter Gastrostomie. Das Gerüst besteht aus Polyurethan (PU) Nanofasern in zylindrischer Form mit einem dreidimensionalen (3D) bedruckten Polycaprolactonstrang, der um die Außenwand gewickelt ist. Vor der Transplantation wurden vom Menschen abgeleitete mesenchymale Stammzellen in das Lumen des Gerüsts eingesät und Bioreaktorkultivierung durchgeführt, um die zelluläre Reaktivität zu verbessern. Wir verbesserten die Transplantat-Überlebensrate, indem wir eine chirurgische Anastomose aufwendeten und die implantierte Prothese mit einer Schilddrüsenklappe bedeckten, gefolgt von einer vorübergehenden nichtoralen Gastrostomiefütterung. Diese Transplantate konnten die Ergebnisse der anfänglichen Epithelisierung und Muskelregeneration rund um die implantierten Stellen rekapitulieren, wie eine histologische Analyse zeigt. Darüber hinaus wurden erhöhte Elastinfasern und Neovaskularisation in der Peripherie des Transplantats beobachtet. Daher stellt dieses Modell eine mögliche neue Technik für die umlaufende Ösophaarterienrekonstruktion dar.
Introduction
Die Behandlung von Ösophaguserkrankungen, wie angeborene Fehlbildungen und Ösophaguskarzinome, kann zu einem strukturellen Segmentverlust der Speiseröhre führen. In den meisten Fällen wurden autologe Ersatztransplantate, wie Zinnen-Pull-up-Leitungen oder Dickdarm-Interpositionen,1,2durchgeführt. Diese Ösophagenerationsersatze haben jedoch eine Vielzahl von chirurgischen Komplikationen und Reoperationsrisiken3. So kann die Verwendung von gewebetechnischen Speiseröhrengerüsten, die die einheimische Speiseröhre imitieren, eine vielversprechende Alternativstrategie zur letztendlichen Regeneration verlorener Gewebe4,5,6sein.
Obwohl eine gewebegefertigte Speiseröhre potenziell eine Alternative zu den aktuellen Behandlungen von Speiseröhrendefekten bietet, gibt es erhebliche Hindernisse für ihre In-vivo-Anwendung. Postoperative anastomotische Leckage und Nekrose des implantierten Speiseröhrengerüsts führen unweigerlich zu einer tödlichen Infektion des umgebenden aseptischen Raumes, wie dem Mediastinum7. Daher ist es äußerst wichtig, eine Kontamination von Lebensmitteln oder Speichel in der Wunde und der nasogastrischen Röhre zu verhindern. Gastrostomie oder intravenöse Ernährung sollte in Betracht gezogen werden, bis die primäre Wundheilung abgeschlossen ist. Bis heute wurde in großen Tiermodellen ösophageale Gewebetechnik durchgeführt, da große Tiere nur durch intravenöse Hyperalimentation für 2-4 Wochen nach der Implantation des Gerüstes8gefüttert werden können. Ein solches nicht-orales Fütterungsmodell wurde jedoch nach einer Ösophadentransplantation bei Kleintieren nicht für ein frühes Überleben etabliert. Das liegt daran, dass die Tiere extrem aktiv und unkontrollierbar waren, so dass sie das Futterrohr über einen längeren Zeitraum nicht im Magen halten konnten. Aus diesem Grund gab es nur wenige Fälle erfolgreicher Ösophaverderntransplantationen bei Kleintieren.
Unter den Gegebenheiten der Speiseröhrengewebetechnik haben wir ein zweilagiges Röhrengerüst aus elektrogesponnenen Nanofasern (Innenschicht; Abbildung 1A) und ein 3D-gedruckter Strang (äußere Schicht; Abbildung 1B) einschließlich einer modifizierten Gastrostomietechnik. Die interne Nanofaser besteht aus PU, einem nicht abbaubaren Polymer, und verhindert das Austreten von Lebensmitteln und Speichel. Die externen 3D-gedruckten Stränge bestehen aus biologisch abbaubarem Polycaprolacton (PCL), das mechanische Flexibilität bieten und sich an die peristaltische Bewegung anpassen kann. Menschliche, aus Fett gewonnene mesenchymale Stammzellen (hAD-MSCs) wurden auf der inneren Schicht des Gerüstes gesät, um die Reepithelisierung zu fördern. Die Nanofaserstruktur kann die anfängliche Schleimhautregeneration erleichtern, indem sie eine strukturelle extrazelluläre Matrixumgebung (ECM) für die Zellmigration bereitstellt.
Wir haben auch die Überlebensrate und Bioaktivität der geimpften Zellen durch Bioreaktorkultivierung erhöht. Das implantierte Gerüst wurde mit einer Schilddrüsenklappe abgedeckt, um eine stabilere Regeneration der Speiseröhrenschleimhaut und Muskelschicht zu ermöglichen. In diesem Bericht beschreiben wir Protokolle für ösophageale Gewebe-Engineering-Techniken, einschließlich Gerüstherstellung, mesenchymale Stammzell-basierte Bioreaktor-Anbau, eine Bypass-Fütterungstechnik mit modifizierter Gastrostomie und eine modifizierte chirurgische Anastomose-Technik zur umlaufenden Ösophatole Rekonstruktion in einem Rattenmodell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bestehende Tierstudien über künstliche Speiseröhren sind nach wie vor durch mehrere kritische Faktoren begrenzt. Das ideale künstliche Speiseröhrengerüst sollte biokompatibel sein und hervorragende physikalische Eigenschaften aufweisen. Es sollte in der Lage sein, das Schleimhautepithel in der frühen postoperativen Periode zu regenerieren, um anastomotische Leckagen zu verhindern. Die Regeneration der inneren kreisförmigen und äußeren Längsmuskelschichten ist auch wichtig für die funktionelle Peristaltik<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, das vom Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt, Republik Korea (Grant-Nummer: HI16C0362) und Basic Science Research finanziert wurde. Programm durch die National Research Foundation of Korea (NRF), finanziert vom Bildungsministerium (2017R1C1B2011132). Die in dieser Studie verwendeten Biospecimen und Daten wurden von der Biobank des Seoul National University Hospital, einem Mitglied des Korea Biobank Network, zur Verfügung gestellt.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
