Vävnadskonstruerad transplantat för circumferential esofagial rekonstruktion hos råttor
Summary
Esofagus rekonstruktion är ett utmanande förfarande, och utveckling av en vävnad-konstruerad matstrupe som möjliggör regenerering av matstrupslemhinnan och muskler och som kan implanteras som ett artificiellt transplantat är nödvändigt. Här presenterar vi vårt protokoll för att generera en konstgjord matstrupe, inklusive byggnadsställningstillverkning, bioreaktorodling och olika kirurgiska tekniker.
Abstract
Användningen av biokompatibla material för omkrets esofagial rekonstruktion är en tekniskt utmanande uppgift hos råttor och kräver en optimal implantatteknik med näringsstöd. Nyligen har det gjorts många försök till esofagusvävnad teknik, men framgången har begränsats på grund av svårigheter i tidig epitet i den speciella miljön av peristaltik. Här utvecklade vi en konstgjord matstrupe som kan förbättra regenereringen av matstrupsslemhinnan och muskellagren genom en tuschig tubulär byggnadsställning, en mesenchymal stamcellsbaserat bioreaktorsystem och en bypassmatningsteknik med modifierad gastrostomi. Byggnadsställningen är tillverkad av polyuretan (PU) nanofibrer i en cylindrisk form med en tredimensionell (3D) tryckt polykaprolactonsträng lindad runt ytterväggen. Före transplantationen sådds mesenchymala stamceller till byggnadsställningens lumen och bioreaktorodling utfördes för att förbättra cellulär reaktivitet. Vi förbättrade transplantat överlevnad genom att tillämpa kirurgisk anastomos och täcker implanterade protes med en sköldkörtelflik, följt av tillfällig nonoral gastrostomy utfodring. Dessa ympkvistar kunde sammanfatta resultaten av inledande epitelisering och muskelregenerering runt de implanterade platserna, vilket framgår av histologisk analys. Dessutom observerades ökad elastinfibrer och karkulakulärisering i transplantatets periferi. Därför presenterar denna modell en potentiell ny teknik för omkrets esofagerad rekonstruktion.
Introduction
Behandling av matstrupssjukdomar, såsom medfödda missbildningar och matstrupscancer, kan leda till strukturell segmentförlust av matstrupen. I de flesta fall, autolog ersättning transplantat, såsom gastric pull-up ledningar eller kolon interpositions, har utförts1,2. Emellertid, dessa esofagus ersättare har en mängd olika kirurgiska komplikationer och återanvändning risker3. Således kan användningen av vävnadskonstruerade esofagsställningar härma den inhemska matstrupen vara en lovande alternativ strategi för att i slutändan regenerera förlorade vävnader4,5,6.
Även om en vävnadskonstruerad matstrupe potentiellt erbjuder ett alternativ till de nuvarande behandlingarna av matstrupsdefekter, finns det betydande hinder för dess in vivo-applicering. Postoperativa anastomotic läckage och nekros av implanterade esofagus byggnadsställning oundvikligen leda till en dödlig infektion i det omgivande aseptiska utrymmet, såsom mediastinum7. Därför är det oerhört viktigt att förhindra mat eller salivkontaminering i såret och nasogastriskröret. Gastrostomy eller intravenös näring bör övervägas tills primära sårläkning är klar. Hittills har esofagus vävnad smittforskning utförts i stora djurmodeller eftersom stora djur kan matas endast genom intravenös hyperalimentation för 2-4 veckor efter implantation avbyggnadsställning8. En sådan ickeoral utfodring modell har dock inte fastställts för tidig överlevnad efter matstrupstransplantation hos små djur. Detta beror på att djuren var extremt aktiva och okontrollerbara, så att de inte kunde hålla matningsröret i magen under en längre tid. Av denna anledning har det förekommit få fall av framgångsrik matstrupstransplantation hos små djur.
Med tanke på omständigheterna kring esofagusvävnad svimering, konstruerade vi en två lager rörformig byggnadsställning bestående av elektrospunnerade nanofibrer (inre lager; Bild 1A)och en 3D-tryckt sträng (yttre skikt; Figur 1B) inklusive en modifierad gastrostomiteknik. Den inre nanofibern är tillverkad av PU, en icke-nedbrytbar polymer, och förhindrar läckage av mat och saliv. De externa 3D-tryckta strängarna är tillverkade av biologiskt nedbrytbar polykaprolak (PCL), som kan ge mekanisk flexibilitet och anpassa sig till peristaltisk rörelse. Mänskliga fett-härledda mesenchymal stamceller (hAD-MSCs) var seedade på det inre lagret av byggnadsställningen för att främja re-epithelization. Nanofiberstrukturen kan underlätta inledande slemhinnans regenerering genom att tillhandahålla en strukturell extracellulär matris (ECM) miljö för cellmigrering.
Vi har också ökat överlevnaden och bioaktiviteten hos de vaccinerade cellerna genom bioreaktorodling. Den implanterade byggnadsställningen var täckt med en sköldkörtelflik för att möjliggöra en stabilare regenerering av matstrupsslemhinnan och muskelskiktet. I denna rapport beskriver vi protokoll för esofagusvävnadsteknik, inklusive byggnadsställningstillverkning, mesenchymal stamcellsbaserad bioreaktorodling, en bypassmatningsteknik med modifierad gastrostomi och en modifierad kirurgisk anastomos teknik för circumferential esofagrekonstruktion i en råtta modell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Befintliga djurstudier på konstgjord matstrupe begränsas fortfarande av flera kritiska faktorer. Den idealiska konstgjorda matstrupsställningen ska vara biokompatibel och ha utmärkta fysiska egenskaper. Det bör kunna regenerera slemhinnan epitel i början av postoperativa perioden för att förhindra anastomotiskt läckage. Regenerering av de inre cirkulära och yttre längsgående muskellagren är också viktigt för funktionell peristaltik12,13.
<p cla…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Korea Health Technology FoU-projektet genom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansierad av ministeriet för hälsa och välfärd, Sydkorea (bidragsnummer: HI16C0362) och Grundläggande vetenskap forskning Program genom National Research Foundation of Korea (NRF) finansierat av undervisningsministeriet (2017R1C1B2011132). De bioprover och data som används i denna studie tillhandahölls av Biobank i Seoul National University Hospital, en medlem av Korea Biobank Network.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
