Génotypage de l'ADN microsatellite et cytométrie des flux Analyses des tissus Hydatidiform Hydradins intégrés paraffins fixés à la formaline
Summary
Les grains de beauté hydatidiformes sont des grossesses humaines anormales avec des étiologies hétérogènes qui peuvent être classées en fonction de leurs caractéristiques morphologiques et de leur contribution parentale aux génomes des molaires. Ici, les protocoles du génotypage et de la cytométrie d’écoulement microsatellites de la paraffine-intégrée des tissus paraffines formalines sont décrits en détail, ainsi que l’interprétation et l’intégration des résultats.
Abstract
La taupe hydatidiform (HM) est une grossesse humaine anormale caractérisée par la prolifération trophoblastique excessive et le développement embryonnaire anormal. Il existe deux types de HM basés sur l’évaluation morphologique microscopique, hm complet (CHM) et HM partiel (PHM). Ceux-ci peuvent être subdivisés en fonction de la contribution parentale aux génomes molaires. Une telle caractérisation de HM, par des analyses de morphologie et de génotype, est cruciale pour la gestion patiente et pour la compréhension fondamentale de cette pathologie intrigante. Il est bien documenté que l’analyse morphologique de HM est sujette à une grande variabilité interobservateur et ne suffit pas à elle seule à classer avec précision HM en CHM et PHM et les distinguer des avortements hydropiques non-molaires. L’analyse du génotypage est principalement effectuée sur l’ADN et les tissus à partir de produits de conception intégrés à la paraffine (FFPE) qui ont une qualité inférieure à l’optimal et peuvent donc conduire à de mauvaises conclusions. Dans cet article, des protocoles détaillés pour les analyses de génotypage multiplex et de cytométrie du flux des tissus molaires FFPE sont fournis, ainsi que l’interprétation des résultats de ces méthodes, leur dépannage, et l’intégration avec l’évaluation morphologique , l’immunohistochimiede KIP2 p57, et l’hybridation in situ de fluorescence (FISH) pour atteindre un diagnostic correct et robuste. Ici, les auteurs partagent les méthodes et les leçons apprises au cours des 10 dernières années de l’analyse d’environ 400 produits de conception.
Introduction
Une taupe hydatidiform (HM) est une grossesse humaine anormale caractérisée par le développement embryonnaire anormal, l’hyperprolifération du trophoblaste, et la dégénérescence hydropic des villosités chorioniques (CV). Historiquement, HM était divisé en deux types, HM complet (CHM) et HM partiel (PHM) basé seulement sur l’évaluation morphologique1. Cependant, il a été démontré que l’évaluation morphologique seule ne suffit pas à classer HM dans les deux sous-types (CHM et PHM) et les distinguer des fausses couches non molaires2,3,4.
Puisque CHM et PHM ont des propensions différentes aux malignités, il est donc important de déterminer avec précision le type génotypique de HM pour fournir le suivi et la gestion appropriés aux patients. Par conséquent, au cours des dernières décennies, plusieurs méthodologies ont été développées et développées dans le but d’identifier la contribution parentale aux tissus molaires et d’atteindre une classification correcte de HM. Il s’agit notamment de l’analyse karyotype, du polymorphisme de baguage chromosomique, de la typage sérologique de l’antigène leucocyte humain (HLA), du polymorphisme de longueur de fragment de restriction, du nombre variable de répétitions de tandem, du génotypage microsatellite, de la cytométrie du débit et du p57 immunohistochimie KIP2. Cela a permis une subdivision précise des conceptions de HM basées sur la contribution parentale à leurs génomes, comme suit: CHM, qui sont diploïdes androgènes monospermiques ou diploïdes dispermiques androgénétiques androgènes, et PHM, qui sont triploïdes, dispermiques dans 99% et monospermic dans 1% des cas5,6,7,8. En outre, il existe un autre type de HM génotypique qui a émergé au cours des deux dernières décennies, qui est biparental diploïde. Ce dernier est principalement récurrent et peut affecter un seul membre de la famille (cas simplex) ou au moins deux membres de la famille (cas familiaux). Ces taupes biparentales diploïdes sont principalement provoquées par des mutations récessives dans NLRP7 ou KHDC3L dans les patients9,10,11,12. Diploid biparental HM chez les patients présentant des mutations récessives dans NLRP7 peut être diagnostiqué comme CHM ou PHM par analyse morphologique et ceci semble être associé à la sévérité des mutations dans les patients13,14. En plus de la classification de HM en fonction de leurs génotypes, l’introduction et l’utilisation de plusieurs méthodes de génotypage ont permis la distinction des différentes entités molaires des fausses couches non molaires, telles que les conceptions biparentales diploïdes anéuploides et d’autres types de conceptions5,15. De telles conceptions peuvent avoir une certaine prolifération de trophoblastet et la morphologie vilaine anormale qui imitent, dans une certaine mesure, quelques dispositifs morphologiques de HM.
Le but de cet article est de fournir des protocoles détaillés pour le génotypage multiplexe et la cytométrie de flux des tissus paraffinés (FFPE) de formaline fixe, et des analyses complètes des résultats de ces méthodes et de leur intégration avec d’autres méthodes pour diagnostic correct et concluant des tissus molaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
HM sont des grossesses humaines anormales avec des étiologies hétérogènes et ont différents types histologiques et génotypiques, ce qui rend leur classification précise et le diagnostic difficile. L’évaluation morphologique histopathologique s’est souvent avérée inexacte et n’est donc pas fiable en soi pour classer HM en CHM et PHM et les distinguer des fausses couches non-molaires. Par conséquent, un diagnostic précis de HM exige l’utilisation d’autres méthodes telles que le génotypage d’ADN microsatellite…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Sophie Patrier et Marianne Parésy d’avoir partagé le protocole original de cytométrie du débit, et Promega et Qiagen d’avoir fourni des fournitures et des réactifs. Ce travail a été appuyé par le Réseau québécois en reproduction et l’Institut canadien de recherche en santé (MOP-130364) à R.S.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
