환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석
Summary
환자 BMPC 견본및 뼈 전이성 전립선암의 이종이식의 3차원 배양은 낭종, 스페로이드 및 복잡한, 종양 같이 organoids의 결과로 그들의 본래 종양의 기능적인 이질성을 유지합니다. 이 원고는 IFC를 사용하여 이기종 환자 유래 샘플 및 이들의 분석의 3D 배양에 대한 최적화 전략 및 프로토콜을 제공한다.
Abstract
인간 환자의 종양 표본과 환자 유래 이종이식(PDX) 전립선암 모델에서 오가노이드의 3차원(3D) 배양, 환자 유래 오르가노이드(PDO)로 지칭되는, 종양 발생 과 전립선 암의 전이. 그들의 주요 장점은 기존의 세포주와 비교하여 본래 조직의 독특한 게놈 및 기능적 이질성을 유지한다는 것이다. 더욱이, PDO의 3D 배양은 개별 적인 환자에 대한 약물 치료의 효력을 예측하기 위하여 이용될 수 있고 개인화한 약을 향한 단계입니다. 이러한 장점에도 불구하고, 몇몇 단은 다른 참을성 있는 견본을 위해 요구될 수 있는 PDO 문화 조건의 광대한 최적화 때문에 부분적으로 이 방법을 일상적으로 이용합니다. 우리는 이전에 우리의 전립선암 뼈 전이 PDX 모델, PCSD1, 항 안드로겐 치료에 기증자 환자의 뼈 전이의 저항을 재입증했다. 우리는 항 안드로겐 저항의 메커니즘을 더 특성화하기 위해 PCSD1 3D 오르가노이드를 사용했습니다. PDX 및 PDO 모델에 대한 현재 발표된 연구에 대한 개요에 따라 최적화된 배양 조건에서 돔형 또는 부동 지하 멤브레인(예: Matrigel) 구를 사용하여 PDO의 3D 배양에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 생체 내 스티치 이미징 및 세포 가입은 세포학에 대해서도 설명되어 있다. 이 프로토콜은 웨스턴 블롯, 공동 배양 등을 포함한 다른 응용 분야에 더욱 최적화될 수 있으며 약물 내성, 종양발생, 전이 및 치료법과 관련된 3D 배양 PDO의 특성을 탐구하는데 사용될 수 있다.
Introduction
3차원 배양 오르가노이드는 생체 내 아키텍처, 세포 기능 및 그들의 원래 조직의 유전적 서명을 되풀이할 수 있는 잠재력에 대해 관심을 끌고 있다1,2,3,4,5. 가장 중요한 것은, 환자 종양 조직 또는 환자 유래 이종이식 (PDX) 모델에서 설립 된 3D organoids는 종양 발생시 세포 신호의 메커니즘을 이해하고 각 세포집단6, 7,8,9,10,11,12,13에대한 약물 치료의 효과를 결정하는 귀중한 기회를 제공한다. Drost 등 5 는 비뇨기과 분야에서 널리 채택된 인간 및 마우스 전립선 오르가노이드의 확립을위한 표준 프로토콜을 개발했습니다. 또한, 3D 오르가노이드의 추가 특성화및 종양발생 및 전이의 상세한 기전을 이해하기 위해상당한 노력이 전념되어 왔다4,12,14,15. 3D 오르가노이드 배양에 대한 이전에 확립되고 널리 인정된 프로토콜 외에도 최적화된 배양 조건에서 세 가지 다른 도밍 방법을 사용하여 PDO의 3D 배양에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다.
이 원고에서, 3D 오르가노이드는 뼈 전이성 전립선암 (BMPC)의 ex vivo 모형으로 설치되었습니다. 이러한 배양에 사용되는 세포는 전립선암 샌디에이고(PCSD) 계열로부터 유래되었으며 환자 전립선암 뼈 전이성 종양 조직(PCSD18 및 PCSD22) 또는 환자 유래 이종이식(PDX) 종양 모델(PCSD1, PCSD13 및 PCSD17)으로부터 직접 유래하였다. 전립선암 세포의 자발적인 골 전이는 유전자 조작 마우스모델(16)에서드물기 때문에, 우리는 인간 종양 세포를 남성Rag2-/-γc-/- 마우스로 직접 대퇴내 주사하여 뼈 전이성 전립선암의 PDX 모델을확립하였다 17.
일단 3D 오르가노이드가 이질적인 환자 종양 세포 또는 환자 유래 이종이식에서 확립되면, 전립선 종양 세포로서의 그들의 정체성을 확인하고 3D 오르가노이드 배양에서 그들의 표현형을 결정하는 것이 필수적이다. 면역형광 화학(IFC)은 각 세포에서 의 단백질 발현을 시각화할 수 있게 하며, 종종 특정 세포 집단에 대한 잠재적인 기능을 나타내는2,4. 일반적으로 조직 및 세포를 포함한 대부분의 시료에 대한 IFC 프로토콜은 간단하고 완전히 최적화되어 있습니다. 그러나, 세포 밀도 및 오르가노이드의 수는 종래의 배양보다 현저히 낮을 수 있다. 따라서, 오르가노이드에 대한 IFC 프로토콜은 샘플의 모든 오르가노이드에 대해 파라핀에 적절한 처리 및 포함을 보장하기 위한 추가 단계가 필요합니다. 우리는 특히 오르가노이드의 샘플이 원하는 것보다 낮은 세포 밀도가있을 때 오르가노이드에 IFC의 성공률을 증가 슬라이드에 단면 오르가노이드의 위치를 표시하는 아가로스 사전 포함 과정에 대한 추가 단계를 설명하고.
Protocol
Representative Results
Discussion
환자 뼈 전이 전립선 암 세포에서 파생 된 3D 오르가노이드는 여전히 상대적으로 드뭅니다. 여기서는 BMPC의 직렬 3D 환자 유래 오르가노이드(PSO)를 성공적으로 확립하기 위한 전략과 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 또한, 프로토콜은 IFC 및 IHC 분석을 위해 더 낮은 세포 밀도를 가진 샘플에서 오르가노이드를 고정하기 위해 설명된다. 낭종, 스페로이드 및 더 복잡한 오르가노이드의 형태로 차동 표…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 레오와 앤 앨버트 자선 재단과 JM 재단에 의해 지원되었다. 우리는 캘리포니아 샌디에고 무어암 센터 회원, Jing Yang 박사 및 케이 T. Yeung 박사가 기술 전문 지식에 대한 수술학과의 마이크로토메와 랜달 프랑스어의 사용을 허용해 주신 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
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