Создание и анализ трехмерных (3D) органоидов, полученных из метастазов костной ткани рака простаты Исты и их Ксенотранспланты
Summary
Трехмерные культуры пациентов BMPC образцов и ксенотрансплантатов костного метастатического рака предстательной железы поддерживать функциональную неоднородность своих оригинальных опухолей в результате чего кисты, сфероиды и сложные, опухолевидные органоиды. Данная рукопись содержит стратегию оптимизации и протокол для 3D-культуры неоднородных образцов, полученных пациентом, и их анализа с использованием МФк.
Abstract
Трехмерная (3D) культура органоидов из опухолевых образцов пациентов и получаемых пациентом ксенотрансплантата (PDX) моделей рака предстательной железы, именуемых органоидами, полученными от пациента (PDO), являются бесценным ресурсом для изучения механизма опухолевого и метастазов рака предстательной железы. Их главным преимуществом является то, что они поддерживают отличительную геномную и функциональную неоднородность оригинальной ткани по сравнению с обычными клеточными линиями, которые этого не делают. Кроме того, 3D культуры PDO могут быть использованы для прогнозирования воздействия лечения наркотиков на отдельных пациентов и являются шагом к персонализированной медицины. Несмотря на эти преимущества, несколько групп обычно используют этот метод отчасти из-за обширной оптимизации условий культуры PDO, которые могут потребоваться для различных образцов пациентов. Ранее мы продемонстрировали, что наша модель метастаза рака простаты PDX, PCSD1, вновь показала устойчивость метастазировать в кости пациента-донора к антиандрогенной терапии. Мы использовали органоиды PCSD1 3D для дальнейшей характеристики механизмов антиандрогенной резистентности. После обзора опубликованных в настоящее время исследований моделей PDX и PDO мы описываем пошаговой протокол для 3D-культуры PDO с использованием куполообразных или плавающих мембран ывейной (например, Matrigel) сфер в оптимизированных условиях культуры. In vivo стежок изображений и обработки клеток для гистологии также описаны. Этот протокол может быть дополнительно оптимизирован для других приложений, включая западный пятно, совместной культуры и т.д., и может быть использован для изучения характеристик 3D культивируемой PDO, относящихся к лекарственной устойчивости, опухолевому, метастазам и терапии.
Introduction
Трехмерные культивированные органоиды обратили внимание на их потенциал для повторения архитектуры in vivo, клеточной функциональности и генетической подписи их оригинальных тканей1,2,3,4,5. Самое главное, 3D органоиды, установленные из опухолевых тканей пациента или пациента производных ксенотрансплантата (PDX) модели предоставляют бесценные возможности для понимания механизмов клеточной сигнализации при опухолевом и определить влияние медикаментозного лечения на каждую популяцию клеток6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 разработали стандартный протокол для создания органов простаты человека и мыши, который был широко принят в области урологии. Кроме того, значительные усилия были направлены на дальнейшую характеристику 3D-органоидов и понимание детальных механизмов опухолевого и метастазов4,12,14,15. В дополнение к ранее установленному и широко принятому протоколу для культур 3D органоидов, мы описываем здесь пошаговой протокол для 3D-культуры PDO, используя три различных метода доминга в оптимизированных условиях культуры.
В этой рукописи, 3D органоиды были созданы в качестве модели ex vivo кости метастатического рака предстательной железы (BMPC). Клетки, используемые для этих культур пришли из рака предстательной железы Сан-Диего (PCSD) серии и были получены непосредственно из метастатического рака простаты метастатических опухолевых тканей (PCSD18 и PCSD22) или пациента производные ксенотрансплантат (PDX) опухоли модели (образцы под названием PCSD1, PCSD13, и PCSD17). Потому что спонтанные метастазы костной ткани раковых клеток редко в генетически модифицированных моделей мыши16, мы использовали прямую внутри-femoral (IF) инъекции человеческих опухолевых клеток в мужской Rag2-/-КК-/- мышей для создания PDX модели кости метастатического рака предстательной железы17.
После того, как 3D органоиды устанавливаются из неоднородных опухолевых клеток пациента или пациента, полученных ксенотрансплантатов, важно, чтобы подтвердить их идентичность в качестве клеток опухоли простаты и определить их фенотипы в 3D органоидных культур. Иммунофлуоресценция химии (IFC) позволяет визуализации экспрессии белка на месте в каждой клетке, часто с указанием потенциальных функций для конкретных популяций клеток2,4. В целом протоколы МФЦ для подавляющего большинства образцов, включая ткани и клетки, просты и полностью оптимизированы. Однако плотность клеток и количество органоидов могут быть значительно ниже, чем у обычной культуры. Поэтому протокол МФК для органоидов требует дополнительных шагов для обеспечения надлежащей обработки и встраивания в парафин для всех органоидов в образцах. Мы описываем дополнительные шаги для процесса предварительного встраивания агарозы и советы по обозначения расположения разделенных органоидов на слайде, что увеличивает показатель успеха МФК на органоидов, особенно когда образцы органоидов имеют более низкую плотность клеток, чем хотелось бы.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D органоиды, полученные из метастазов костей пациента раковых клеток предстательной железы по-прежнему относительно редки. Здесь мы описываем стратегии и дальнейший оптимизированный протокол для успешно говорутого серийного 3D-пациента, полученных из органов (PDF) BMPC. Кроме того, описан…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Благотворительным фондом Лео и Анны Альберт и Фондом JM. Мы благодарим Калифорнийского университета в Сан-Диего Мурс онкологический центр членов, д-р Цзин Ян и д-р Кей Т. Енг за предоставленную нам возможность использовать их микротомы и Рэндалл французский, Департамент хирургии для технических знаний.
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- . Keyence Fluorescence Microscope Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019)
