Etablering og analyse af tredimensionale (3D) organoider afledt af patient prostatakræft Bone Metastase prøver og deres Xenografts
Summary
Tre-dimensionelle kulturer af patientenBMPC prøver og xenografts af knogle metastatisk prostatakræft opretholde den funktionelle heterogenitet af deres oprindelige tumorer resulterer i cyster, sfænoider og komplekse, tumor-lignende organoider. Dette manuskript giver en optimeringsstrategi og protokol for 3D-kultur af heterogene patientafledte prøver og deres analyse ved hjælp af IFC.
Abstract
Tredimensional (3D) kultur af organoider fra tumorprøver af humane patienter og patient-afledt xenograft (PDX) modeller af prostatakræft, benævnt patient-afledte organoider (BOB), er en uvurderlig ressource for at studere tumorigenese og metastase af prostatakræft. Deres største fordel er, at de opretholder den karakteristiske genomiske og funktionelle heterogenitet af det oprindelige væv i forhold til konventionelle cellelinjer, der ikke gør. Desuden kan 3D-kulturer af BOB bruges til at forudsige virkningerne af narkotikabehandling på de enkelte patienter og er et skridt i retning af personlig medicin. På trods af disse fordele, få grupper rutinemæssigt bruge denne metode til dels på grund af den omfattende optimering af BOB kulturbetingelser, der kan være nødvendige for forskellige patientprøver. Vi har tidligere vist, at vores prostatakræft knogle metastase PDX model, PCSD1, opsummerede modstanden af donor patientens knogle metastase til anti-androgen terapi. Vi brugte PCSD1 3D organoids til yderligere at karakterisere mekanismerne i anti-androgen modstand. Efter en oversigt over aktuelt offentliggjorte undersøgelser af PDX- og BOB-modeller beskriver vi en trinvis protokol for 3D-kultur af BOB ved hjælp af kuppelformede eller flydende kældermembraner (f.eks. matrigel) i optimerede kulturforhold. In vivo sting billeddannelse og celle behandling for histologi er også beskrevet. Denne protokol kan yderligere optimeres til andre applikationer, herunder vestlige blot, co-kultur, etc. og kan bruges til at udforske karakteristika 3D kulturfremstillede BOB vedrørende resistens, tumorigenese, metastase og terapeutiske.
Introduction
Tre-dimensionelle kulturformede organoider har henledt opmærksomheden på deres potentiale til at opsummere in vivo arkitektur, cellulære funktionalitet og genetiske signatur af deres oprindelige væv1,2,3,4,5. Vigtigst er det, 3D organoider etableret fra patient tumor væv eller patient afledt xenograft (PDX) modeller giver uvurderlige muligheder for at forstå mekanismer af cellulære signalering ved tumorigenese og til at bestemme virkningerne af narkotikabehandling på hver celle population6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 udviklet en standard protokol for etablering af menneskelige og mus prostata organoider, som er blevet bredt vedtaget inden for urologi. Desuden har en betydelig indsats været dedikeret til yderligere karakterisering af 3D organoids og til at forstå de detaljerede mekanismer tumorigenese og metastase4,12,14,15. Ud over den tidligere etablerede og bredt accepterede protokol for 3D organoids kulturer, beskriver vi her en trin-for-trin protokol for 3D-kulturen i BOB ved hjælp af tre forskellige doming metoder i optimerede kulturforhold.
I dette manuskript blev 3D organoider etableret som en ex vivo model af knogle metastatisk prostatakræft (BMPC). De celler, der anvendes til disse kulturer kom fra Prostata Cancer San Diego (PCSD) serien og blev afledt direkte fra patienten prostatakræft knogle metastatisk tumorvæv (PCSD18 og PCSD22) eller patient afledt xenograft (PDX) tumor modeller (prøver ved navn PCSD1, PCSD13, og PCSD17). Da spontan knoglemetastase af prostatakræftceller er sjælden i gensplejsede musemodeller16,brugte vi direkte intrafemoral (IF) injektion af humane tumorceller i mandlige Rag2-/-γc-/- mus til at etablere PDX-modeller af knoglemetastatisk prostatakræft17.
Når 3D organoids er etableret fra heterogene patient tumorceller eller patient afledte xenografts, Det er vigtigt at bekræfte deres identitet som prostata tumorceller og til at bestemme deres fænotyper i 3D organoid kulturer. Immunfluorescenskemi (IFC) gør det muligt at visualisering af proteinekspression på stedet i hver celle, hvilket ofte angiver de potentielle funktioner for specifikke cellepopulationer2,4. Generelt er IFC protokoller for et stort flertal af prøver, herunder væv og celler ligetil og fuldt optimeret. Men celletætheden og antallet af organoider kan være betydeligt lavere end den konventionelle kultur. Ifc-protokollen for organoider kræver derfor yderligere skridt til at sikre korrekt behandling og integrering i paraffin for alle organoider i prøverne. Vi beskriver yderligere trin for en agarose pre-indlejring proces og tips til at mærke placeringen af afgrænsede organoider på diaset, der øger succesraten for IFC på organoider, især når prøverne af organoider har lavere celletæthed end ønsket.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D organoider stammer fra patienten knogle metastase prostatakræft celler er stadig relativt sjældne. Her beskriver vi strategier og yderligere optimeret protokol til succes etableret seriel 3D patient afledt organoider (PDA’er) af BMPC. Desuden beskrives protokoller for at sikre organoiderne i prøver med lavere celletæthed for IFC- og IHC-analyse. Differentialfænotyper i form af cyste, sfænoider og mere komplekse organoider viser, at denne protokol giver kulturbetingelser, der giver mulighed for heterogonous tumor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Leo og Anne Albert Charitable Foundation og JM Foundation. Vi takker University of California San Diego Moores Cancer Center medlemmer, Dr. Jing Yang og Dr. Kay T. Yeung for at give os mulighed for brug af deres microtome og Randall fransk, Department of Surgery for teknisk ekspertise.
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- . Keyence Fluorescence Microscope Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019)
