患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析
Summary
患者のBMPC標本および骨転移性前立腺癌の異種移植片の三次元培養は、嚢胞、回転楕円および複雑な腫瘍様オルガノイドをもたらす元の腫瘍の機能的不均一性を維持する。本稿は、異種患者由来サンプルの3D培養とIFCを用いた解析のための最適化戦略とプロトコルを提供します。
Abstract
ヒト患者の腫瘍標本からのオルガノイドの三次元(3D)培養および前立腺癌の患者由来異種移植片(PDX)モデルは、患者由来オルガノイド(PDO)と呼ばれ、そのメカニズムを研究するための貴重な資源である。前立腺癌の腫瘍形成と転移。彼らの主な利点は、彼らがそうしない従来の細胞株と比較して、元の組織の特徴的なゲノムと機能的不均一性を維持することです。さらに、PDOの3D培養は、個々の患者に対する薬物治療の影響を予測するために使用することができ、パーソナライズされた医療への一歩です。これらの利点にもかかわらず、いくつかのグループは、異なる患者のサンプルに必要な可能性のあるPDO培養条件の広範な最適化のために、この方法を日常的に使用しています。我々は、我々の前立腺癌骨転移PDXモデル、PCSD1が、抗アンドロゲン療法に対するドナー患者の骨転移の抵抗を再現したことを以前に実証した。我々は、PCSD1 3Dオルガノイドを用いて、抗アンドロゲン抵抗性のメカニズムをさらに特徴付けた。PDXおよびPDOモデルの現在発表されている研究の概要に続いて、我々は最適化された培養条件でドーム型または浮遊基基盤膜(例えば、マトリゲル)球を用いたPDOの3D培養のためのステップバイステッププロトコルを記述する。インビボでは、ヒストロジーのための細胞処理と画像化と細胞処理も記載されている。このプロトコルは、ウェスタンブロット、共培養、等を含む他の用途のためにさらに最適化することができ、薬剤耐性、腫瘍形成、転移および治療薬に関する3D培養PDOの特性を探索するために使用することができる。
Introduction
三次元培養オルガノイドは、生体内アーキテクチャ、細胞機能性および元の組織の遺伝的シグネチャを再現する可能性に注目されている1,2,3,4,5.最も重要なことは、患者腫瘍組織または患者由来異種移植片(PDX)モデルから確立された3Dオルガノイドは、腫瘍形成に関する細胞シグナル伝達のメカニズムを理解し、各細胞集団6、7、8、9、10、11、12、13に対する薬物治療の効果を決定する貴重な機会を提供する。Drostら5は泌尿器科の分野で広く採用されているヒトおよびマウス前立腺オルガノイドの確立のための標準プロトコルを開発した。また、3Dオルガノイドのさらなる特徴付けに多大な努力が行われ、腫瘍形成および転移の詳細なメカニズムを理解するために4,12,14,15.3D オルガノイド培養のための以前に確立され、広く受け入れられているプロトコルに加えて、我々は最適化された培養条件の3つの異なるドミン法を用いてPDOの3D培養のためのステップバイステップのプロトコルをここに記述する。
本稿では、3Dオルガノイドを骨転移性前立腺癌(BMPC)の元生体モデルとして確立した。これらの培養物に使用される細胞は、前立腺癌サンディエゴ(PCSD)シリーズから来て、患者前立腺癌骨転移性腫瘍組織(PCSD18およびPCSD22)または患者由来異種移植片(PDX)腫瘍モデル(PCSD1、PCSD13、およびPCSD17という名前のサンプル)から直接得られた。前立腺癌細胞の自発的な骨転移は遺伝子組み換えマウスモデル16ではまれであるため、ヒト腫瘍細胞の雄Rag2—γc-/-マウスへの直接の大腿内注射を使用して、骨転移性前立腺癌のPDXモデルを確立した17。
異種患者腫瘍細胞または異種移植片由来の患者から3Dオルガノイドが確立されたら、前立腺腫瘍細胞としての同一性を確認し、3Dオルガノイド培養でそれらの表現型を決定することが不可欠です。免疫蛍光化学(IFC)は、各細胞におけるその中のタンパク質発現の可視化を可能にし、特定の細胞集団2、4に対する潜在的な機能を示すことが多い。一般に、組織や細胞を含むサンプルの大部分に対するIFCプロトコルは、簡単で完全に最適化されています。しかし、細胞密度およびオルガノイドの数は、従来の培養物よりも有意に低くすることができる。したがって、オルガノイドのIFCプロトコルは、サンプル内のすべてのオルガノイドのパラフィンに適切な処理と埋め込みを確実にするために追加のステップを必要とします。アガロースの埋め込み前プロセスの追加手順と、特にオルガノイドのサンプルが所望よりも低い細胞密度を有する場合に、オルガノイド上のIFCの成功率を増加させるスライド上のセクション化オルガノイドの位置を標識するヒントを説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
前立腺癌細胞の骨転移に由来する3Dオルガノイドは、依然として比較的稀である。ここでは、BMPCのシリアル3D患者由来オルガノイド(PTO)を正常に確立するための戦略およびさらに最適化されたプロトコルについて説明する。さらに、プロトコルはIFCおよびIHC分析のための低い細胞密度のサンプルのオルガノイドを確保するために記述されている。嚢胞、回転楕円体およびより複雑なオルガノイ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、レオとアンアルバート慈善財団とJM財団によって支援されました。カリフォルニア大学サンディエゴ・ムーアズがんセンターのメンバー、ジンヤン博士、ケイ・T・ヨン博士は、マイクロトームとランドール・フレンチ外科部の技術的専門知識を利用してくれたことに感謝します。
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
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