Summary
Qui descriviamo un nuovo metodo per rilevare la creazione di successo della circolazione condivisa del sangue di due parabionts attraverso un'iniezione di vena caudale di glucosio, che provoca danni minimi e non è fatale per i parabionts.
Abstract
La parabiosi è un metodo sperimentale per combinare chirurgicamente due animali paralleli lungo l'asse longitudinale del corpo. Vi presentiamo un protocollo per rilevare il successo del chimerismo del sangue nei parabionts da un'iniezione caudale di glucosio. Sono stati costruiti topi parabiotici. Il glucosio è stato iniettato nel topo donatore attraverso la vena della coda, e la fluttuazione del livello di glucosio nel sangue è stata misurata in entrambi i topi utilizzando un glucometer del sangue in diversi punti di tempo. I nostri risultati hanno mostrato che dopo l'iniezione di glucosio, il livello di glucosio nel sangue nei topi donatori è aumentato bruscamente dopo 1 min e è diminuito lentamente in seguito. Nel frattempo, il livello di glucosio nel sangue dei topi ricittori ha raggiunto il picco di 15 min dopo l'iniezione. Risultati simili sono stati ottenuti con Evans blu, utilizzato come un controllo positivo per il glucosio. La fluttuazione sincrona dei livelli di glucosio nel sangue indica che il flusso sanguigno tra i due topi è stato stabilito con successo.
Introduction
La parabiosi è un metodo di modellazione in cui due organismi viventi vengono uniti chirurgicamente e si sviluppano come un unico sistema fisiologico con un sistema circolatorio condiviso1. Tali modelli sono stati ampiamente utilizzati per studiare la fisiologia a causa del vantaggio che le sostanze prodotte da un singolo individuo possono agire su entrambi gli animali contemporaneamente attraverso il sistema circolatorio condiviso. Dalla metà del 1800, quando gli esperimenti parabiotici sono stati introdotti da Paul Bert2,i metodi per la costruzione di modelli parabiotici sono diventati standardizzati. Tuttavia, manca un metodo semplice e conveniente per verificare il successo dell'instaurazione del chimerismo del sangue. È stato riferito che la circolazione incrociata può essere valutata con successo iniettando intraperitonealmente 0,5% di colorante blu Eevans in uno dei parabioni seguito dalla misurazione dell'assorbimento di Evans blu nel sangue di entrambi i parabiont con un lettore di micropilla3. Un altro metodo richiede una razza ditopo specifica che contiene CD45.1 - e CD45.2-monociti etichettati in ogni parabiont. La citometria cellulare viene quindi utilizzata per determinare il chimerismo del sangue misurando la frequenza dei due marcatori nei monociti dalla milza o dal sangue4. Tuttavia, questi metodi sono spesso letali o ingombranti per gli animali, e un metodo semplice e sicuro per una verifica rapida e affidabile dei modelli parabiotici è altamente auspicabile. In questo studio, abbiamo stabilito un nuovo metodo per questo scopo, che è stato convalidato in un modello murino di parabiosi. La concentrazione di glucosio in campioni di sangue prelevati da una vena della coda viene misurata utilizzando un glucometer, e il modello dei cambiamenti del livello di glucosio nei topi donatori e riceventi è considerato un'indicazione del chimerismo della circolazione. Abbiamo chiamato questo metodo il "metodo di fluttuazione del glucosio". L'applicazione di questo metodo di convalida non è limitata ai topi, ma potrebbe essere estesa a diversi modelli patologici ad eccezione di quelli con grave disregolazione del metabolismo del glucosio. La procedura è semplice, salvaile il tempo e sicura.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali e la loro cura sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Harbin Medical.
NOTA: gli strumenti e le attrezzature necessari per il metodo sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione di materiali e animali
- Ordinare c57BL/6 topi maschi con peso compreso tra 20 g-25 g da un fornitore di animali da laboratorio standard.
- Ospita i topi in un ciclo di luce di 12 h: 12 h di buio a 24,26 gradi centigradi con accesso ad alto libitum all'acqua e al cibo.
2. Parabiosi
- Anestesizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di 20 g/L 2,2,2-tribromoetanolo ad una concentrazione di 0,1 mL/10 g. Confermare l'anestesizzazione corretta come indicato dal rilassamento muscolare, dalla respirazione lenta e costante, dalla perdita di riflesso della stimolazione cutanea e dalla scomparsa del riflesso corneale.
- Applicare unguento oftalmico con una punta Q per evitare gli occhi asciutti.
- Eseguire la procedura di parabiosi come descritto in precedenza5.
- Posizionare i topi in posizione supina. Radere accuratamente il lato sinistro di un topo e il lato destro dell'altro mouse a partire da circa 1 cm sopra il gomito a 1 cm sotto il ginocchio con un rasoio elettrico. Utilizzare crema depilatoria per eliminare completamente la pelliccia sulla pelle rasata.
- Pulire le aree rasate con iodophor. Posizionare i topi su un cuscinetto riscaldato coperto da un cuscinetto sterile.
- Creare incisioni longitudinali della pelle partendo da 0,5 cm sopra il gomito a 0,5 cm sotto l'articolazione del ginocchio utilizzando un paio di forbici affilate sul lato rasato di ogni animale.
- Staccare la pelle dalla fascia sottocutanea delicatamente dopo l'incisione.
- Collegare l'olecranon e il ginocchio del parabiont con una sutura 3-0.
- Suturare la pelle rasata con una sutura continua 5-0.
- Iniettare 0,5 mL di 0,9% NaCl sottocutaneamente a ciascun topo per prevenire la disidratazione.
- Iniettare tramadolo (10 mg/25 g/giorno) intramuscolare a ogni topo per alleviare il dolore.
3. Convalida del chimerismo di circolazione
- Metodo di fluttuazione del glucosio
NOTA: Verificare la riuscita costruzione del chimerismo di circolazione tra parabiont utilizzando il metodo di fluttuazione del glucosio (nessun digiuno) il decimo giorno dopo l'intervento chirurgico di parabiosi.- Anestesizzare i parabionts mediante iniezione intraperitoneale di 20 g/L 2,2-tribromoetanolo a ciascun topo ad una concentrazione di 0,1 mL/10 g.
- Fissare i topi donatori in un fissatore di coda venoso topo visivo.
- Strofinare le vene caudali sul fianco di una coda del parabiont con un batuffolo di cotone imbevuto di 70-75% di alcol per pulire la coda e dilatarlare i vasi sanguigni.
- Tenere una siringa da 1,0 mL contenente glucosio nella mano destra e mantenere l'ago parallelo alla vena (meno di 15 gradi).
- Inserire l'ago in una posizione di circa 2-4 cm dalla punta della coda.
- Inietta1 100 l di glucosio (1,2 g/kg) nel donatore entro 10 s.
NOTA: Il termine donatore si riferisce al parabiont che riceve l'iniezione di glucosio attraverso la vena della coda. Il destinatario è l'altro parabiont, che non riceve direttamente il glucosio. - Pulire le alture con iodophor. Tagliare le alture del donatore e dei topi ricitati con una forbice e raccogliere una goccia di sangue in diversi punti temporali dopo l'iniezione di glucosio (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min e 60 min). Rimuovere il coagulo di sangue ad ogni punto di raccolta per evitare ulteriori danni.
NOTA: Il volume di sangue raccolto è stato di 10-25 ul per un test e 90-225 ul in totale. - Gocciolare il sangue nel centro delle strisce di prova glucometer per il rilevamento del livello di glucosio.
- Utilizzare Counterstain blu di Evan come controllo positivo3.
- Iniettare nel topo donatore 200 L dello 0,5% blu di Evan Counterstain.
- 2 h più tardi, eutanasia i parabionts mediante iniezione intraperitoneale di 20 g/L 2,2,2-tribromoetanolo per ogni topo ad una concentrazione di 0,2 mL/10 g, e raccogliere il sangue da entrambi i parabioni per puntura cardiaca.
- Centrifugare i campioni di sangue a 916 x g per 15 min.
- Raccogliere il siero dal supernatante.
- Diluire il siero con lo 0,9% NaCl all'1:50.
- Misurare l'assorbimento dei campioni di siero diluito a 620 nm con uno spettrometro.
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Representative Results
In sei topi donatori, i livelli di glucosio nel sangue sono nettamente aumentati a 26,5 mall/L (aumento del 173%) ad una media di 1 min dopo l'iniezione di 100 l di glucosio (1,2 g/kg) attraverso la vena della coda e poi sono gradualmente diminuiti a 13,3 smol a 60 min. Nei topi ricintori, la glicemia è aumentata lentamente dopo l'iniezione e ha raggiunto il primo livello di picco a 15 min (aumento del 47%, 12,2 zol/L). Sulla base dei risultati di cui sopra, lo standard per il chimerismo di circolazione è stato impostato come segue: 1) un forte aumento del livello di glucosio nel sangue (un aumento minimo del 100% o >20 zmol/L) nei topi donatori entro 1 min dopo l'iniezione di glucosio, e 2) un aumento significativo del livello di glucosio nel sangue nei topi riceventi 15 min dopo l'iniezione (un minimo di 37% di aumento) (Figura 1).
La concentrazione di colorante blu Evans nel siero dei parabiont sciolse ha anche indicato il successo della costruzione del chimerismo di circolazione (Figura 2). Abbiamo eutanasia i parabiont dopo la misurazione della glicemia utilizzando 5 mL di 2,2,2 tribromoetanolo (20 g/L). Le giunzioni vascolari sottocutanee tra i parabiont sono state chiaramente osservate (Figura 3).
La Figura 1 supplementare mostra che i topi donatori avevano un significativo aumento del livello di glucosio nel sangue di 1 min dopo l'iniezione di glucosio, mentre il livello di glucosio nel sangue dei topi riceventi non è stato elevato, il che ha dimostrato che il chimerismo di circolazione nei parabiont non è stato stabilito con successo 1 giorno dopo l'intervento chirurgico di parabiosi. Analogamente, il livello di OD nel sangue nei topi riceventi non era elevato come quello dei topi donatori (Figura supplementare 2).
Sulla base dei risultati del metodo della fluttuazione del glucosio, abbiamo scoperto che due coppie di parabionts non hanno stabilito il chimerismo del sangue 15 giorni dopo l'intervento chirurgico di parabiosi. Come mostrato nella Tabella supplementare 1, i due topi ricitati non avevano un aumento del livello di glucosio nel sangue entro 60 min dopo l'iniezione di glucosio nei topi donatori. Anche la concentrazione di sangue di Evans blu nei due destinatari non era elevata (Tabella supplementare 2), che dimostrava che il metodo della fluttuazione del glucosio era sensibile quanto il metodo blu di Evans.
Inoltre, per valutare l'influenza del glucosio iniettato sul metabolismo dell'insulina, abbiamo rilevato il livello di insulina nel sangue 1 h e 3 h dopo l'iniezione di 100 l di glucosio (1,2 g/kg) nei topi (Figura supplementare 3). Il livello di insulina nel sangue è stato notevolmente diminuito 1 h dopo l'iniezione di glucosio a causa del rapido aumento del glucosio e recuperato a livelli normali a 3 h. Questi risultati hanno dimostrato che gli effetti del glucosio che abbiamo iniettato sul metabolismo dell'insulina erano riutilizzabili.
Figura 1: Cambiamenti del livello di glucosio nel sangue nei parabiont dopo l'iniezione di glucosio attraverso la vena caudale. (A) Livello di glucosio nel sangue dei topi donatori. (B) Livello di glucosio nel sangue dei topi ricognitori destinatari (n ) I dati vengono presentati come la media : SEM.
Figura 2: La concentrazione di blu Evans in campioni di siero di parabionts misurati da un lettore di micropilla. I dati sono presentati come la media : SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Generazione di vasoganglions sottocutanei nella pelle connessa tra i parabiont. Sinistra: Immagine rappresentativa dei topi parabiosi. A destra: Un'immagine rappresentativa del vasoganglion sottocutaneo tra i parabionts. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Il livello di glucosio nel sangue di parabionts è stato testato 1 giorno dopo l'intervento chirurgico parabiosi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 2: La concentrazione di blu evelsuta dal lettore di micropilfi nel siero dei parabionts 1 giorno dopo la chirurgia parabiosi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 3: La concentrazione di insulina nel siero dei topi dopo l'iniezione di glucosio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 0 min | 5 min | 15 min | 20 min | 40 min | 60 min | |
| Donatore-1 | 5.7 | 26.2 | 21.2 | 17.6 | 16.9 | 15.4 |
| Destinatario-1 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
| Donatore-2 | 8.4 | 25.5 | 21.1 | 20.5 | 17.4 | 13.8 |
| Destinatario-2 | 6.7 | 5.8 | 5.9 | 6.2 | 5.2 | 5.4 |
Tabella supplementare 1: Livello di glucosio nel sangue (Mol/L) nei parabionts 15 giorni dopo l'intervento chirurgico di parabiosi.
| Controllo 1 | Donatore-1 | Destinatario-1 | Controllo 2 | Donatore-2 | Destinatario-2 | |
| Valore OD | 0.059 | 0.935 | 0.062 | 0.068 | 0.862 | 0.073 |
Tabella supplementare 2: Concentrazione di sangue di verdedive (valore OD) nei parabionts 15 giorni dopo l'intervento chirurgico di parabiosi.
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Discussion
La parabiosi si riferisce alla tecnica chirurgica di collegamento di due animali viventi per stabilire un sistema vascolare comune con mezzisperimentali 6,7,8. Il vantaggio di questo modello è che le sostanze prodotte da un singolo individuo possono agire su entrambi gli animali contemporaneamente. Così, il modello di parabiosi può essere utilizzato per esplorare il ruolo di una sostanza o fattore in una malattia correlata, producendo molte conclusioni significative e innovative. In considerazione del suo grande valore applicativo, il modello ha portato a una migliore comprensione delle malattie del sistema cardiovascolare8,9,10 ,11,12 ,12,13, disturbi del sistema nervoso14,15, trapianto d'organo16, e diabete17,18.
Tuttavia, la verifica della creazione di successo del chimerismo di circolazione è il primo e determinante passo per gli studi con parabiosi. Gli studi attuali hanno segnalato alcuni metodi per rilevare il chimerismo di circolazione. Loffredo et al.4 ha riferito che il chimerismo del sangue è stato confermato in coppie parabiotiche misurando la frequenza mista dei monociti nella milza con diversi marcatori etichettati nei topi donatori (CD45.1) e riceventi (CD45.2). In questo metodo, sono stati utilizzatiper il parabiosi di CD45.1 - o CD45.2-monociti etichettati. La citometria cellulare era necessaria per determinare il chimerismo del sangue misurando l'integrazione delle cellule del sangue marcate. Inoltre, Marta et al.3 ha valutato la circolazione incrociata iniettando intraperitonealmente 200 -L di 0,5% Evans colorante blu in uno dei parabionts. Il sangue di entrambi i parabiont è stato raccolto 2 h più tardi per puntura cardiaca. Il chimerismo del sangue è stato determinato da un aumento della concentrazione blu di Evans nei topi ricamici, che è stata testata da un lettore di microplaci. Anche se queste strategie ci permettono di determinare il chimerismo del sangue, ci sono ancora molte limitazioni che non possono essere ignorate. In primo luogo, per i metodi letali, il chimerismo del sangue può essere confermato solo all'esecuzione. Tuttavia, nel nostro metodo, l'istituzione del chimerismo del sangue può essere testato in qualsiasi momento dopo la chirurgia parabiosi. I parabiont con chimerismo di circolazione stabilito senza successo possono essere esclusi per ulteriori studi in anticipo per ridurre il carico di lavoro non necessario. Infatti, utilizzando il nostro metodo di fluttuazione del glucosio siamo stati in grado di individuare i topi con costruzione infruttuosa del chimerismo del sangue in alcuni parabionts, che potrebbe essere dovuto a tempo insufficiente di parabiosi, manipolazione chirurgica instabile, guarigione ritardata delle ferite o tessuto corporeo scollegato causato da difficoltà animali. In tali circostanze, il fallimento del chimerismo del sangue è stato confermato anche utilizzando il metodo blu Divelsi. Questi risultati indicano che il metodo della fluttuazione del glucosio era efficace quanto il metodo blu di Evans (Figura supplementare 1 e Figura supplementare 2, Tabella supplementare 1 e Tabella supplementare 2). In secondo luogo, i metodi di convalida attualmente utilizzati sono eccessivamente dispendiosi in termini di tempo e difficili, al contrario di questo nuovo metodo, che è semplice ed efficace.
Nel presente studio, abbiamo testato con successo il chimerismo di circolazione nei topi parabiotici con il metodo della fluttuazione del glucosio. I topi sono stati anestesizzati per l'iniezione di glucosio e le misurazioni del livello di glucosio, che hanno reso la loro manipolazione più facile. Abbiamo iniettato 100 l di glucosio (1,2 g/kg) attraverso la vena posteriore dei topi entro 10 s. In queste condizioni, è stata osservata una fluttuazione regolare dei livelli di glucosio nel sangue nei topi donatori e riceventi. È importante sottolineare che la quantità di glucosio che abbiamo usato tendeva ad elevare stabilmente il livello di glucosio nel sangue entro un certo intervallo. Inoltre, i risultati hanno mostrato che il livello di insulina nel sangue recuperato al normale intervallo 3 h dopo l'iniezione di glucosio (Figura supplementare 3), suggerendo che la quantità di glucosio iniettato nei topi ha avuto effetti minimi sul metabolismo dell'insulina. Inoltre, il dosaggio di glucosio che abbiamo dato al donatore era inferiore a quello utilizzato per il test di tolleranza al glucosio dei topi (per il GTT, 2 g/kg di glucosio è iniettato per via intraperitamente ai topi, pari a circa 1,6 g/kg attraverso l'iniezione di vena caudale19,20,21), il che significa che il dosaggio di glucosio per il metodo della fluttuazione del glucosio non causerebbe alterità iperstupida e altre alterazioni. In conclusione, il metodo che abbiamo usato è efficace, innocuo e risparmio di tempo. Tuttavia, potrebbe essere limitato ai topi diabetici in parabiosi, che hanno ancora bisogno di ulteriori esperimenti per la conferma.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Nature Science Foundation of China (81570399 e 81773735), dal National Key Research and Development Program of China - Traditional Medicine Modernization Research (2017YFC1702003) e da Hei Long Jiang Eccezionale Fondo scientifico giovanile (JC2017020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| curved forceps | JZ surgical Instruments, China | J31340 | |
| fine scissors | JZ surgical Instruments, China | WA1030 | |
| needle forcep | JZ surgical Instruments, China | 60017961 | |
| 2.5 mL syringes | Agilent, USA | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, USA | T48402-5G | |
| penicillin | Solarbio, China | IP0150 | |
| tramadol | Yijishiye, China | YJT712520 | |
| glucometer | Roche Diabetes Care, Indiana | Accu-Chek Active test strips | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, China | G1810 | |
| depilatory cream | Nair, USA | LL9161 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp, USA | TP-22G | |
| Electrical shaver | Codos, China | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 surgical suture |
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
References
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