Выражение, очищение и липосома Связывание подающих надежды дрожжей SNX-BAR Heterodimers
Summary
Здесь мы представляем рабочий процесс для выражения, очищения и липосомы связывания гетеродимеров SNX-BAR в дрожжах.
Abstract
Белки SNX-BAR являются эволюционно сохраненным классом мембранных белков, которые играют ключевую роль в сортировке и обороте белков и липидов во время эндоцитоза, сортировки внутри эндосомальной системы и аутофагии. Центральное место в функции белка SNX-BAR является способность формировать гомодимеры или гетеродимеры, которые связывают мембраны с использованием высоко консивенных фокс-гомологии (PX) и BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) доменов. Кроме того, олигомеризация димеров SNX-BAR на мембранах может вызвать образование мембранных трубок и пузырьков, и эта деятельность, как полагают, отражает их функции в качестве белков пальто для эндосомного происхождения транспортных носителей. Исследователи уже давно используют in vitro связывающие исследования с использованием рекомбинантных белков SNX-BAR на синтетических липосомы хипоссомы или гигантские unilamellar пузырьки (GUVs), чтобы выявить точный состав липидов, необходимых для привода мембраны ремоделирования, тем самым раскрывая их механизм действия. Однако, из-за технических проблем с системами двойного выражения, токсичности экспрессии белка SNX-BAR в бактериях, и плохой растворимости отдельных белков SNX-BAR, большинство исследований на сегодняшний день изучили Гомодидеры SNX-BAR, в том числе нефизиологические димы, которые образуются во время выражения в бактериях. Недавно мы оптимизировали протокол для преодоления основных недостатков типичной бактериальной системы экспрессии. Используя этот рабочий процесс, мы демонстрируем, как успешно выражать и очищать большое количество гетеродимеров SNX-BAR и как восстановить их на синтетических липосомах для связывания и трубообразного анализов.
Introduction
Мембранные органеллы, такие как плазменная мембрана, эндоплазмический ретикулум, аппарат Голги, лизосомы (дрожжи вакуола) и эндосомы, составляют эндомембранную систему эукариотической клетки. Большинств органеллы имеют способность связывать и обменивать материал с другими organelles через переносится везикулы. Как ячейка координирует упаковку и формирование везикуловых транспортных носителей в рамках эндомембранной системы, не очень понятно. Тем не менее, белки и липиды, которые составляют большую часть эндомембранной системы, как известно, происходят из интернализации эндоцитарных пузырьков из плазменной мембраны (PM). Эндосомя является основной органелью приема для этих пузырьков и состоит из нескольких взаимосвязанных наборов трубчатых органелл. Основная функция эндосомы заключается в содействии приобретению питательных веществ, регулировать оборот белка и липидов, защищать от патогенной инфекции, а также служить основным источником пополнения липидов для плазменной мембраны. Поскольку эндосома получает основную часть грузовых белков и липидов из плазменной мембраны, она действует как сортировочный отсек, изолируя грузы в трубчатые эндосомальные транспортные носители (ETC). Любые белки, не секвестрированные в ETCs, остаются деградированными через эндо-лисосомную систему. Дисрегуляция сортировки грузов в ETCs может привести к потере поглощения питательных веществ, текучесть белка или липидного гомеостаза, что приводит к многочисленным метаболическим, развития и неврологическим расстройствам1,2. Однако, несмотря на центральную роль ETCs в эндосоме, основной механизм того, как эндосома может выборочно координировать упаковку множества неоднородных грузов в трубчатые носители, неизвестен.
Сортировка nexin (SNX) семейство эволюционно сохраненный класс белков, которые были найдены, чтобы иметь решающее значение для многих реакций везикул транспорта в клетке3,4,5. Сортировка нэксинов набираются в эндосомную мембрану и помогают в захвате груза через характерный фаркс-гомологический (PX) домен, который связывает фосфатидинозиноситол-3-монофосфат (PtdIns(3)P), липид, обогащенный на эндосомной мембране. Млекопитающие кодируют тридцать три белка SNX, которые могут быть дополнительно разделены на несколько подсемейств, в зависимости от наличия других доменов1. Наиболее примечательно, что подсемейство SNX-BAR является крупнейшим подсемейством, состоящим из двенадцати человек, в то время как в подающих надежды дрожжах, Saccharomyces cerevisiae, подсемейство сводится всего до семи SNX-BARs. Белки SNX-BAR имеют как домен PX, так и домен Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR), который вызывает липидные резервуары для связывания положительных мембран кривизны. Следовательно, семья SNX-BAR имеет естественное сродство к эндосому и может посредничать образование ETC через их мембранные способности ремоделирования. В пробирке, ремоделирование свойства SNX-BARs может быть вызвано добавлением очищенных SNX-BARs к синтетическим липосомам и последующее образование узких, покрытых трубами могут быть визуализированы с помощью электронной микроскопии. Используя эти методы, исследователи определили, что как концентрация олигомеризации и прочность сужения, как представляется, различаются среди семьи SNX-BAR предполагая, что они могли бы помочь как в формировании и ножницы ETCs.
SNX-BARs могут быть дополнительно классифицированы по их эксклюзивным свойствам димеризации. В пробирке связывания анализы и структурные исследования показали, что SNX-BAR белки могут образовывать только конкретные homodimers или гетеродимы. Таким образом, в принципе, каждый потенциальный SNX-BAR димер-олигомер может обеспечить трубчатый слой для грузоперевозок, а также, ограниченная олигомеризация других протомеров SNX-BAR, может также определять различные пути экспорта. Однако, из-за большого количества SNX-BARs и разнообразия в семейство SNX, одна сортировка nexin-один грузовой гипотеза весьма маловероятно. Вместо этого более вероятно скоординированное усилие с использованием множества факторов, таких как SNX-BARs, груз, липидная специфичность и другие зависимости. Аналогичным образом, недавние исследования дрожжей семьи SNX4 показали доказательства для дополнительной липидной специфичности, за PtdIns (3)P, чтобы потенцировать эндосомы транспортных перевозчиков6. В этом исследовании, SNX-BAR гомодимер MVP1-MVP1 был очищен от бактерий и родной heterodimers Snx4-Atg20 и Vps5-Vps17 были выражены и очищены в высокой урожайности от дрожжей, в то время как только Snx4-Atg20 было установлено, что предпочтительно связывать фосфатидилсериин (PS) и узкая форма. В то время как другие в этой области выявили важные свойства SNX-BARs с использованием рекомбинантно очищенных SNX-BAR homodimers от бактерий, токсичность, связанная с выражением SNX-BAR гетеродимеров в аналогичных системах, препятствовала их родной характеристике7,8,9,10. Поэтому, без надежной системы получения чисто рекомбинантно выраженных местных гетеродимеров, исследователи должны отойти от этих направлений исследования. На рисунке 1, мы представляем четыре части рабочего процесса до 1) построить штамм дрожжей overexpressing SNX-BAR гетеродимеров для тандема сродство очистки, 2) выразить и очистить родной SNX-BAR гетеродимеров, 3) подготовить unilamellar синтетические липосомы, и 4) создать липосомы трубуляции или осадок исследует, обеспечивая жизненно важный инструмент для исследователей, чтобы исследовать растущий каталог сортировки nexins найти в природе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы демонстрируем оптимизированный рабочий процесс для очистки димеров SNX-BAR в дрожжах и два анализа для оценки их биофизических свойств на синтетических липосомах. Основным преимуществом перед типичным рекомбинантным выражением белка в Escherichia coli или других системах являетс…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, о которых сообщается в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии GM060221 и частично Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здоровья под номером премии T32GM007223. Р.К. была частично поддержана Программой грантов на научные гранты факультета КООН и Шарлотта.
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
