Expression, purification et liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers
Summary
Ici, nous présentons un flux de travail pour l’expression, la purification et la liaison liposome des hétérodimères DeNX-BAR dans la levure.
Abstract
Les protéines SNX-BAR sont une classe évolutivement conservée de protéines de remodelage membranaire qui jouent un rôle clé dans le tri et le trafic de protéines et de lipides pendant l’endocytose, le tri dans le système endosomal, et l’autophagie. La fonction protéique SNX-BAR est au cœur de la fonction protéique SNX-BAR, soit la capacité de former des homodimères ou des hétérodistes qui lient les membranes en utilisant des domaines phox-homologie (PX) et BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) très conservés. En outre, l’oligomerisation des diététistes SNX-BAR sur les membranes peut provoquer la formation de tubules et de vésicules membranaires et cette activité est censée refléter leurs fonctions de protéines de couche pour les transporteurs de transport dérivés de l’endosome. Les chercheurs ont longtemps utilisé des études de liaison in vitro utilisant des protéines Recombinantes SNX-BAR sur des liposomes synthétiques ou des vésicules unilamellaires géantes (VGU) pour révéler la composition précise des lipides nécessaires pour conduire le remodelage de la membrane, révélant ainsi leur mécanisme d’action. Cependant, en raison de défis techniques avec les systèmes à double expression, la toxicité de l’expression des protéines SNX-BAR chez les bactéries, et la faible solubilité des protéines SNX-BAR individuelles, la plupart des études à ce jour ont examiné les homodimères SNX-BAR, y compris les dieux non physiologiques qui se forment lors de l’expression chez les bactéries. Récemment, nous avons optimisé un protocole pour surmonter les lacunes majeures d’un système d’expression bactérienne typique. À l’aide de ce flux de travail, nous démontrons comment exprimer et purifier avec succès de grandes quantités d’hétérodistes SNX-BAR et comment les reconstituer sur des liposomes synthétiques pour les essais de liaison et de tubulation.
Introduction
Les organites membranaires tels que la membrane plasmatique, le réticulum endoplasmique, l’appareil Golgi, le lysosome (vacuole de levure) et l’endosome composent le système endomembrane de la cellule eucaryotique. La plupart des organites ont la capacité de communiquer et d’échanger du matériel avec d’autres organites par l’intermédiaire de transporteurs de vésicules. La façon dont la cellule coordonne l’emballage et la formation des transporteurs de vésicules dans le système endomembrane n’est pas bien comprise. Cependant, les protéines et les lipides qui constituent une grande partie du système endomembrane sont connus pour provenir de l’intériorisation des vésicules endocytiques de la membrane plasmatique (PM). L’endosome est l’organelle d’acceptation primaire pour ces vésicules et est composé de multiples ensembles interconnectés d’organites tubulaires. La fonction principale de l’endosome est de faciliter l’acquisition de nutriments, de réguler le renouvellement des protéines et des lipides, de protéger contre les infections pathogènes et de servir de principale source de réapprovisionnement en lipides pour la membrane plasmatique. Comme l’endosome reçoit la majeure partie des protéines de cargaison et des lipides de la membrane plasmatique, il agit comme un compartiment de tri en isolant les cargaisons dans les transporteurs tubulaires de transport endosomal (ETC). Toutes les protéines non séquestrées dans les ETC sont laissées à être dégradées par le système endo-lysosomal. La dysrégulation du tri des cargaisons dans les ETC peut entraîner une perte d’absorption des nutriments, d’un renouvellement des protéines ou d’une homéostasie lipidique, ce qui entraîne de nombreux troubles métaboliques, développementaux et neurologiques1,2. Cependant, en dépit du rôle central des ETC à l’endosome, le mécanisme sous-jacent de la façon dont l’endosome peut coordonner sélectivement l’emballage d’une multitude de cargaisons hétérogènes dans les transporteurs tubulaires n’est pas connu.
La famille de la nexinde de tri (SNX) est une classe évolutivement conservée de protéines qui se sont avérées critiques pour de nombreuses réactions de transport de vésicules dans la cellule3,4,5. Les nexins de tri sont recrutés à la membrane endosome et aident à capturer la cargaison par leur domaine caractéristique d’homologie de phox (PX), qui lie le phosphatidylinositol-3-monophosphate (PtdIns(3)P), un lipide enrichi sur la membrane endosome. Les mammifères codent trente-trois protéines SNX, qui peuvent être encore divisées en plusieurs sous-familles, selon la présence d’autres domaines1. Plus particulièrement, la sous-famille SNX-BAR est la plus grande sous-famille composée de douze chez l’homme, tandis que dans la levure en herbe, Saccharomyces cerevisiae, la sous-famille est réduite à seulement sept SNX-BARs. Les protéines SNX-BAR ont à la fois un domaine PX et un domaine Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) qui déclenche des réservoirs lipidiques pour lier les membranes de courbure positives. Par conséquent, la famille SNX-BAR a une affinité naturelle pour l’endosome et peut médiatisation formation ETC via leurs capacités de remodelage de la membrane. In vitro, les propriétés de remodelage de SNX-BARs peuvent être induites par l’ajout de SNX-BARs purifiés aux liposomes synthétiques et la formation ultérieure de tubules étroits et enduits peut être visualisée par microscopie électronique. En utilisant ces méthodes, les chercheurs ont déterminé que la concentration d’oligomerisation et la force de constriction semblent varier parmi la famille SNX-BAR suggérant qu’ils pourraient aider à la fois dans la formation et la scission des ETC.
Les SNX-BARs peuvent être classés par leurs propriétés de dimerisation exclusives. Des essais de liaison in vitro et des études structurelles ont démontré que les protéines SNX-BAR ne peuvent former que des homodimères ou des hétérodistes spécifiques. Par conséquent, en principe, chaque dimère-oligomère SNX-BAR potentiel pourrait fournir un manteau de tubule pour une voie de trafic spécifique à la cargaison et, de même, l’oligomerisation restreinte des autres protomères SNX-BAR, peut également définir des voies d’exportation distinctes. Cependant, en raison du grand nombre de SNX-BARs et de la diversité au sein de la famille SNX, une hypothèse de chargement nexin-one est très peu probable. Au lieu de cela, un effort coordonné utilisant une multitude de facteurs tels que SNX-BARs, la cargaison, la spécificité lipidique et d’autres dépendances est plus probable. De même, des études récentes de la famille de levure SNX4 ont révélé des preuves pour la spécificité lipidique supplémentaire, au-delà de PtdIns(3)P, pour potentialiser les transporteurs de transport endosome6. Dans cette étude, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 a été purifié à partir de bactéries et les hétérodistes indigènes Snx4-Atg20 et Vps5-Vps17 ont été exprimés et purifiés à haut rendement de levure, tandis que seulement Snx4-Atg20 a été trouvé pour lier de préférence phosphatidylserine (PS) et la forme étroite tube-comme les structures dans les études de liposome liaison6. Alors que d’autres dans le domaine ont révélé des propriétés importantes de la SNX-BARs en utilisant recombinantly purifié SNX-BAR homodimers de bactéries, la toxicité associée à l’expression SNX-BAR hétérodistes dans des systèmes similaires ont entravé leur caractérisation indigène7,8,9,10. Par conséquent, sans un système fiable pour obtenir des hétérodimères natifs exprimés de façon recombinante pure, les chercheurs doivent renoncer à ces lignes d’investigation. Dans la figure 1, nous présentons un flux de travail en quatre parties à 1) construire une souche de levure surexprimant SNX-BAR hétérodistes pour la purification d’affinité tandem, 2) exprimer et purifier les hétérodistes natifs de SNX-BAR, 3) préparer des liposomes synthétiques unilamellar, et 4) mettre en place une tubulation liposome ou des sédimentations d’analyse, fournissant un outil essentiel pour les chercheurs d’étudier le catalogue croissant de nexins de tri trouvés dans la nature.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous démontrons un flux de travail optimisé pour purifier les dissipateurs SNX-BAR dans la levure et deux essais pour évaluer leurs propriétés biophysiques sur des liposomes synthétiques. Le principal avantage par rapport à l’expression typique des protéines recombinantes dans Escherichia coli ou d’autres systèmes est la capacité d’exprimer uniformément les protéines SNX-BAR dans un hôte indigène, évitant ainsi les problèmes de toxicité et d’insolubilité présents dans la purification des …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les recherches rapportées dans cette publication ont été soutenues par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de prix GM060221 et en partie par l’Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de la santé sous le numéro de récompense T32GM007223. R.C. a reçu l’appui en partie du Programme de subventions de recherche de la Faculté de l’UNC-Charlotte.
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
