Uttrykk, rensing, og liposome binding av spirende gjær SNX-BAR heterodimerer
Summary
Her presenterer vi en arbeidsflyt for uttrykk, rensing og liposome binding av SNX-BAR heterodimerer i gjær.
Abstract
SNX-BAR proteiner er en evolutionarily, bevart klasse av membran remodeling proteiner som spiller nøkkelroller i sortering og smugling av proteiner og lipider under endocytose, sortering i endosomal systemet, og autofagi. Sentralt i SNX-BAR protein funksjon er evnen til å danne homodimers eller heterodimerer som binder membraner ved hjelp av svært bevarte phox-homologi (PX) og BAR (bin/Amphiphysin/RVs) domener. I tillegg kan oligomerisering av SNX-BAR dimers på membraner lokke fram dannelsen av membran tubuli og blemmer, og denne aktiviteten er antatt å reflektere deres funksjoner som pels proteiner for endosome-avledet transport bærere. Forskere har lenge utnyttet in vitro bindende studier ved hjelp av rekombinant SNX-BAR proteiner på syntetiske liposomer eller gigantiske unilamellære blemmer (GUVs) for å avdekke presis makeup av lipider som trengs for å drive membran remodeling, og dermed avsløre deres virkningsmekanisme. Men på grunn av tekniske utfordringer med doble uttrykks systemer, toksisitet av SNX protein uttrykk i bakterier, og dårlig løselighet av individuelle SNX-BAR proteiner, har de fleste studier hittil undersøkt SNX-BAR homodimers, inkludert ikke-fysiologiske dimers som dannes underuttrykk i bakterier. Nylig har vi optimalisert en protokoll for å overvinne de store svakhetene ved en typisk bakteriell uttrykk system. Ved hjelp av denne arbeidsflyten demonstrerer vi hvordan du kan uttrykke og rense store mengder SNX-heterodimerer og hvordan du Rekonstituer dem på syntetiske liposomer for bindende og tubulation analyser.
Introduction
Membran-bundet organeller som plasma membranen, den endoplasmatiske retikulum, det Golgi apparatet, lysosome (gjær vacuole), og endosome utgjør endomembrane systemet av eukaryote cellen. De fleste organeller har evnen til å kommunisere og utveksle materiale med andre organeller gjennom vesicle transport bærere. Hvordan cellen koordinerer emballasjen og dannelsen av vesicle transport bærere innenfor endomembrane systemet er ikke godt forstått. Imidlertid er proteiner og lipider som utgjør mye av endomembrane systemet kjent for å stamme fra internalizing endocytic blemmer fra plasma membranen (PM). Endosome er den primære Acceptor organelle for disse blemmer og består av flere sammenkoblede sett av rørformede organeller. Den viktigste funksjonen til endosome er å lette nærings kjøp, regulere protein og lipid omsetning, beskytte mot patogen infeksjon, og å tjene som den primære påfyll av lipider for plasma membranen. Etter hvert som endosome mottar Hovedtyngden av Last proteiner og lipider fra plasma membranen, fungerer den som et sorterings rom ved å isolere cargos inn i rørformede endosomal transport bærere (ETCs). Alle proteiner som ikke er sequestered i ETCs, blir etterlatt for å bli degradert via Endo-lysosomal-systemet. Den feilregulering av Last sortering i ETCS kan føre til tap av næringsinnhold opptak, protein omsetning eller lipid homeostase, noe som resulterer i mange metabolske, utviklingsmessige, og nevrologiske lidelser1,2. Til tross for ETCs sentrale rolle ved endosome, kan imidlertid den underliggende mekanismen for hvordan endosome selektivt koordinerer emballasjen til en rekke heterogene cargos i rørformede bærere ikke er kjent.
The sortering nexin (SNX) familie er en evolutionarily bevart klasse av proteiner som har blitt funnet å være avgjørende for mange vesicle transport reaksjoner i cellen3,4,5. Sortering nexins er rekruttert til endosome membran og bistand i lasten fangst via deres karakteristiske phox homologi (PX) domene, som binder phosphatidylinositol-3-monofosfat (PtdIns (3) P), en lipid beriket på endosome membran. Pattedyr kode 33 SNX proteiner, som kan videre deles inn i flere underfamilier, i henhold til tilstedeværelsen av andre domener1. Mest spesielt er SNX-BAR gruppe den største gruppe bestående av tolv i menneske, mens i spirende gjær, Saccharomyces cerevisiae, gruppe er redusert til bare syv SNX-barer. SNX-BAR proteiner har både en PX domene og en bin-Amphiphysin-RVs (BAR) domene som utløser lipid reservoarer å binde positive krumning membraner. Følgelig SNX-BAR-familien har en naturlig affinitet for endosome og kan megle ETC formasjon via deres membran remodeling evner. In vitro, remodeling egenskapene til SNX-barer kan bli indusert ved tilsetning av renset SNX-barer til syntetiske liposomer og den påfølgende dannelsen av smale, belagt tubuli kan bli visualisere av elektron mikroskopi. Ved hjelp av disse metodene, har forskerne fastslått at både oligomerisering konsentrasjon og innsnevring styrke ser ut til å variere blant SNX-BAR familien antyder de kunne hjelpe i både dannelse og scission av ETCs.
Den SNX-barer kan bli ytterligere klassifisert av sine eksklusive dimerization egenskaper. Analyser og strukturelle studier har vist at SNX-BAR proteiner bare kan danne spesifikke homodimers eller heterodimerer. Derfor, i prinsippet, kan hver potensiell SNX-BAR dimer-oligomer gi en tubule pels for en Last-spesifikk menneskehandel sti og likeledes, den begrensede oligomerisering av de andre SNX-BAR protomers, kanne likeledes definere distinkte eksport trasé. Men på grunn av det store antallet SNX-barer og mangfoldet i SNX-familien, er det svært usannsynlig med én sorterings nexin-en Last hypotese. I stedet en koordinert innsats ved hjelp av en rekke faktorer som SNX-barer, Last, lipid spesifisitet og andre avhengigheter er mer sannsynlig. Likeledes, nyere studier av gjær SNX4 familien avdekket bevis for ekstra lipid spesifisitet, utover PtdIns (3) P, til forsterke endosome transport bærere6. I denne studien, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 ble renset fra bakterier og innfødte heterodimerer Snx4-Atg20 og Vps5-Vps17 ble uttrykt og renset i høy avkastning fra gjær, mens bare Snx4-Atg20 ble funnet å fortrinnsvis bind fosfatidylserin (PS) og danner smale rør-lignende strukturer i liposome bindende studier6. Mens andre i feltet har avdekket viktige egenskaper av SNX-barer bruker recombinantly renset SNX-bar homodimers fra bakterier, har toksisitet forbundet med å uttrykke SNX-bar heterodimerer i lignende systemer hindret deres innfødte karakterisering7,8,9,10. Derfor, uten et pålitelig system for å få rene recombinantly uttrykt innfødt heterodimerer, må forskerne avkall disse linjene av etterforskningen. I figur 1, presenterer vi en fire-del arbeidsflyt til 1) konstruere en gjær STAMME overexpressing SNX-bar heterodimerer for tandem affinitet rensing, 2) uttrykke og RENSE native SNX-bar heterodimerer, 3) forberede unilamellære syntetiske liposomer, og 4) sette opp en liposome tubulation eller sedimentations analysen, som gir et viktig verktøy for forskere å undersøke den voksende katalog av sortering nexins funnet i naturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi en optimalisert arbeidsflyt for å rense SNX-BAR-dimers i gjær og to analyser for å evaluere sine Biofysiske egenskaper på syntetiske liposomer. Den største fordelen over typiske rekombinant protein uttrykk i Escherichia coli eller andre systemer er evnen til å uttrykke SNX-bar proteiner i en innfødt vert, og dermed unngår toksisitet og uoppløselig problemer som finnes i rensende SNX-barer i andre systemer. Det er også bemerkelsesverdig at systemet ikke krever molekylær kloning eller harbo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under pris nummer GM060221 og delvis av National Institute of General Medical Sciences i National Institutes av helse under tildeling nummer T32GM007223. R.C. ble støttet delvis av UNC-Charlotte fakultet Research Grants program.
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
