Udtryk, oprensning, og Liposom binding af spirende gær SNX-BAR heterodimers
Summary
Her præsenterer vi en arbejdsgang for udtryk, rensning og Liposom binding af SNX-BAR Heterodimere i gær.
Abstract
SNX-BAR proteiner er en evolutionært bevaret klasse af membran remodeling proteiner, der spiller nøgleroller i sortering og handel med protein og lipiderne under endokytose, sortering inden for endosomale system, og autophagy. Central til SNX-BAR protein funktion er evnen til at danne homodimers eller Heterodimere, der binder membraner ved hjælp af stærkt bevaret phox-Homology (PX) og BAR (bin/Amphiphysin/RVS) domæner. Desuden kan oligomerisering af snx-bar dimerer på membraner fremkalde dannelsen af membran tubuler og vesikler, og denne aktivitet menes at afspejle deres funktioner som pels proteiner til endosome-afledte transportvirksomheder. Forskere har længe udnyttet in vitro bindende undersøgelser ved hjælp af rekombinant snx-bar proteiner på syntetiske Liposomer eller gigantiske af vesikler (guvs) at afsløre den præcise makeup af lipider er nødvendige for at drive membran Remodeling, og dermed afsløre deres virkningsmekanisme. Men på grund af tekniske udfordringer med Dual Expression systemer, toksicitet af snx-bar protein ekspression i bakterier, og dårlig Opløselighed af individuelle snx-bar proteiner, de fleste undersøgelser til dato har undersøgt snx-bar homodimers, herunder ikke-fysiologiske dimerer, der dannes under ekspression i bakterier. For nylig har vi optimeret en protokol for at overvinde de store mangler ved et typisk bakterielt udtryks system. Ved hjælp af denne arbejdsgang viser vi, hvordan man med held udtrykker og renser store mængder af SNX-BAR Heterodimere, og hvordan man rekonstruere dem på syntetiske Liposomer til bindende og tubulations assays.
Introduction
Membranbundne organeller såsom plasma membranen, endoplasmatiske reticulum, Golgi-apparatet, lysosom (gær vakuole) og endosome udgør endomembrane-systemet i eukaryote-cellen. De fleste organeller har evnen til at kommunikere og udveksle materiale med andre organeller gennem vesikle transport bærere. Hvordan cellen koordinerer emballering og dannelse af vesikle transport bærere inden for endomembrane systemet er ikke godt forstået. Men de proteiner og lipider, som udgør meget af endomembrane systemet er kendt for at stamme fra internalisere endokytiske vesikler fra plasma membranen (PM). Endosome er den primære acceptor organelle for disse vesikler og består af flere sammenkoblede sæt af rørformede organeller. Den vigtigste funktion af endosome er at lette næringsstof erhvervelse, regulere protein og lipid omsætning, beskytte mod patogen infektion, og til at fungere som den primære genopfylde kilde til lipider til plasma membranen. Da endosome modtager hovedparten af last proteiner og lipider fra plasma membranen, fungerer det som sorterings kammer ved at isolere Cargos i rørformede endosomale transport bærere (ETCs). Eventuelle proteiner, der ikke er opdelt i ETCs, er overladt til at blive forringet via endo-lysosomal-systemet. Dysreguleringen af sortering af lasten i ETCs kan føre til tab af næringsstofoptagelse, protein omsætning eller lipid homøostase, hvilket resulterer i talrige metaboliske, udviklingsmæssige og neurologiske lidelser1,2. Men til trods for den centrale ETCs-rolle i endosome er den underliggende mekanisme for, hvordan endosome selektivt kan koordinere emballeringen af en lang række heterogene laster i rørformede bærere, ikke kendt.
Den sortering nexin (snx) familie er en evolutionært bevaret klasse af proteiner, der har fundet at være kritisk for mange vesikelprotein transport reaktioner i cellen3,4,5. Sortering nexins er rekrutteret til endosome membran og støtte i Cargo Capture via deres karakteristiske phox Homologi (px) domæne, som binder phosphatidylinositol-3-monophosphat (ptdins (3) P), en lipid beriget på endosome membran. Pattedyr indkode 33 SNX proteiner, som kan yderligere opdeles i flere underfamilier, i henhold til tilstedeværelsen af andre domæner1. Især snx-bar familien er den største under familie bestående af tolv mennesker, mens der i spirende gær, Saccharomyces cerevisiae, under familien er reduceret til bare syv snx-barer. SNX-BAR proteiner har både en PX domæne og en bin-Amphiphysin-RVS (BAR) domæne, der udløser lipid reservoirer til at binde positive krumning membraner. Derfor SNX-BAR familie har en naturlig affinitet for endosome og kan mægle osv dannelse via deres membran remodeling evner. In vitro, remodeling egenskaber af SNX-BARs kan induceres ved tilsætning af renset SNX-BARs til syntetiske Liposomer og den efterfølgende dannelse af smalle, coatede tubuler kan visualiseres ved elektronmikroskopi. Ved hjælp af disse metoder, forskerne har fastslået, at både oligomerisering koncentration og konstriktion styrke synes at variere blandt snx-bar familie tyder på, at de kunne støtte i både dannelse og bedriftssammenlægning af ETCs.
Snx-BARs kan yderligere klassificeres ved deres eksklusive denne egenskaber. In vitro-bindende analyser og strukturelle undersøgelser har vist, at SNX-BAR proteiner kun kan danne specifikke homodimers eller Heterodimere. Derfor kan hver potentiel SNX-BAR dimer-oligomer i princippet give en tubulær frakke til en fragt specifik smugler vej, og ligeledes, den begrænsede oligomerisering af de andre SNX-BAR protomers, også definere særskilte eksportveje. Men på grund af det store antal SNX-barer og mangfoldighed inden for SNX-familien er en enkelt sortering nexin-One Cargo-hypotese højst usandsynlig. I stedet en koordineret indsats ved hjælp af en lang række faktorer, såsom SNX-barer, last, lipid specificitet og andre afhængigheder er mere sandsynligt. Ligeledes, nylige undersøgelser af gær SNX4 familie afslørede beviser for yderligere lipid specificitet, ud over PtdIns (3) P, at forstærke endosome transport luftfartsselskaber6. I denne undersøgelse, snx-bar homodimer Mvp1-Mvp1 blev renset fra bakterier og indfødte heterodimers Snx4-Atg20 og Vps5-Vps17 blev udtrykt og renset i højt udbytte fra gær, mens kun Snx4-Atg20 blev fundet at fortrinsvis binde Phosphatidylserin (PS) og danne smalle rør-lignende strukturer i Liposom bindende undersøgelser6. Mens andre i marken har afsløret vigtige egenskaber af snx-barer ved hjælp af rekombinant renset snx-bar homodimers fra bakterier, toksicitet forbundet med at udtrykke snx-bar Heterodimere i lignende systemer har hindret deres indfødte karakterisering7,8,9,10. Derfor, uden et pålideligt system til at opnå ren rekombinant udtrykte indfødte Heterodimere, skal forskerne give afkald på disse linjer for undersøgelse. I figur 1præsenterer vi en fire-del arbejdsproces til 1) konstruere en gærstamme overudtrykker snx-bar Heterodimere for tandem affinitet rensning, 2) udtrykke og rense indfødte snx-bar Heterodimere, 3) forberede af syntetiske Liposomer, og 4) oprette en liposomtubulation eller sedimentations assay, der giver et vigtigt redskab for forskere til at undersøge det voksende katalog af sortering nexiner findes i naturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her demonstrerer vi en optimeret arbejdsgang for at rense SNX-BAR-dimere i gær og to assays for at evaluere deres biofysiske egenskaber på syntetiske Liposomer. Den største fordel i forhold til typisk rekombinant protein udtryk i Escherichia coli eller andre systemer er evnen til jævnt at udtrykke snx-bar proteiner i en indfødt vært, således at undgå toksicitet og inopløselighed spørgsmål fundet i RENSENDE Snx-barer i andre systemer. Det er også bemærkelsesværdigt, at vores system ikke kræver Mole…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tildeling nummer GM060221 og til dels af National Institute of General Medical Sciences af de nationale institutter Sundhedstilstand under tildelings nummer T32GM007223. R.C. blev delvist støttet af UNC-Charlotte Fakultets Forskningstilskuds program.
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
