מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד חדירות המעי של האלגיה. שיטה זו מועילה למחקרים ביולוגיים בסיסיים על בריאות המעיים הקשורים לאינטראקציה בין בקטריה מעיים למארחים שלהם ולהקרנה כדי לזהות פרוביוטיקה וחומרים כימיים כדי לרפא תסמונת המעיים הדולף ומחלות המעי דלקתיות.
Abstract
באורגניזמים חיים, היפרסטרוביליות מעיים היא סימפטום רציני המוביל למחלות מעיים דלקתיות רבות (IBDs). האלגיה היא מודל בעלי חיים שאינו מדיה , המשמש רבות כמערכת שיטת שיטה, בשל תוחלת החיים הקצרה, השקיפות, העלות והאפקטיביות, והיעדר בעיות באתיקה בעלי ממון. במחקר זה, פותחה שיטה כדי לחקור את ההשפעות של חיידקים שונים 3, 3 ‘-diindolylmethane תאן (עמום) על חדירות המעיים של C. אלגיה עם מערכת ניתוח תמונה בתפוקה גבוהה. התולעים נדבקו בחיידקים שונים או מטופלים עם DIM עבור 48 h וניזון עם fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran לילה. לאחר מכן נבדק חדירות המעי על ידי השוואת הדימויים הפלואורסצנטית ועוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בתוך גופי התולעת. שיטה זו עשויה להיות גם הפוטנציאל לזהות פרוביוטיקה וחיידקים מעיים פתוגניים המשפיעים על חדירות המעי במודל החי והוא יעיל לבדיקת ההשפעות של מזיקים או בריאות לקידום הכימיקלים על חדירות המעי ובריאות המעיים. עם זאת, פרוטוקול זה יש גם כמה מגבלות משמעותיות ברמה הגנטית, במיוחד לקביעת אילו גנים משתנים לשלוט במחלות, כי שיטה זו משמשת בעיקר להגדרה פנוטימית. בנוסף, שיטה זו מוגבלת לקביעת בדיוק איזה מצעים פתוגניים לגרום לדלקת או להגדיל את החדירות של המעיים של התולעים במהלך הזיהום. לכן, מחקרים מעמיקים יותר, כולל חקירה של המנגנון הגנטי המולקולרי באמצעות חיידקים מוטציה, נמטודות, כמו גם ניתוח מרכיב כימי של חיידקים, נדרשים להעריך באופן מלא את התפקוד של חיידקים וכימיקלים בקביעת חדירות המעי.
Introduction
חדירות המעי נחשב אחד המחסומים העיקריים הקשורים המעי microbiota וחסינות רירית והוא צפוי להיות מושפע על ידי מספר גורמים, כגון שינויים microbiota בטן, ליקוי אפיתל, או שינוי שכבת ריר1. העיתונים האחרונים דיווחו על פרוטוקולים יעילים כדי למדוד את חדירות המעי של תאי מעיים אנושיים על ידי ניתוח שיעורי השטף הזריחה על פני שכבת התא מעיים2, אבל מחקרים פחות להציג הליך מתאים למדידת חדירות הבטן ב nematodes, במיוחד ב -C. אלגיה, על ידי שימוש בצביעת fitc-dextran.
קיימים שני פרוטוקולים מייצגים למדידת חדירות הבטן ב -C. אלגיה באמצעות הנילוס האדום3 ואריאולאוצין דינתרן (או שיטת הדרדס)4,5. בפרוטוקול זה, השתמשנו FITC-dextran (משקל מולקולרי ממוצע 10,000), אשר יש משקל מולקולרי הרבה יותר גבוה מאשר הנילוס אדום (MW = 318.37) ו-dioglaucine דינתרן (MW = 792.85). Fitc-dextran דומה יותר הנילוס האדום או erioglaucine ניתרן חומרי מזינים macromolecular בפועל כגון פחמימות, אשר נספגים דרך שכבת המעי. ניתן להעריך בקלות את חדירות המעיים של מערכת המזון המומנת של המעי הקיסרי . עם זאת, בתוך שיטת הדרדס, ניתוח כמותי של חדירות המעי קשה עקב חוסר סטנדרטיזציה ויש להעריך ידנית4,5. במקרה של הסדר האדום של הנילוס, אדום הנילוס כתמי גם טיפות שומנים בתאים, אשר עלול להפריע להגדרה המדויקת של חדירות הבטן בג6. הפרוטוקולים הנוכחיים מאפשרים ניתוח כמותי מהיר ומדויק של חדירות המעיים ב -C. אלגיה המטופלת בחיידקים וכימיקלים שונים תוך הימנעות מהכתמים שומנים בלתי ספציפיים.
ג. אלגיה הוא מודל אופייני בתחומים ביולוגיים בשל מחירו הסביר, מניפולציה קלה, בעיות מוגבלות בבעלי חיים, ותוחלת חיי קצר, המועילה לניסויים מהירים7. בפרט, לאחר הוצאת הגנום c. אלגיה , כמעט 40% מהגנים בגנום c. אלגיה הינם אורתוולוגי לגנים הגורמים למחלות אנושיות8. יתר על כן, הגוף השקוף מאפשר התבוננות בתוך האורגניזם, אשר יתרון עבור מחקר אירועים סלולריים ליישומים הפלואורסצנטית בביולוגיה התא, למשל, תא גזע מכתים עם DAPI או אימונוהיסטוכימיה9. ג. אלאנים משמשים לעתים קרובות כבעל חיים ניסיוני כדי ללמוד את האינטראקציה בין מיקרוביוטה הבטן לבין הפונדקאי; בנוסף, C. אלגיהns משמש למסך בריאות לקידום חיידקים פרוביוטיקה10,11,12 , כמו גם כימיקלים תזונתיים לקידוםבריאותהמעיים 13,14.
פסאודומונס aeruginosa ובידור faecalis הם חיידקים ידועים הבטן כי לרעה להשפיע על מערכת העיכול, במיוחד את התאים האפיתל חוקן של בדרכי המעיים15,16. לכן, מדידת חדירות הבטן המופעל על ידי חיידקים אלה הוא הכרחי להקרנה ופיתוח של תרופות חדשות שיכולות להתאושש ולהפחית את הנזק שנגרם על ידי דלקת בקטריאלי וזיהום. בפרוטוקול זה בדקנו את ההשפעות של חיידקי המעי האלה על חדירות המעיים של הג.
כמו כן אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימלי לבדיקת כימיקלים על חדירות המעיים של הג. למטרה זו, השתמשנו 3, 3 ‘-diindolylmethane תאן (DIM) כמו מודל כימי משום עמום הוא מתחם אקטיביים מטבוליט נגזר של אינדול-3-carbinol, אשר קיים בצמחי מזון הבהקרוסי, ו דווח כי יש השפעות טיפוליות על ibd בעכברים17,18. בנוסף, גילינו לאחרונה כי DIM משפר את התפקוד הלקוי של חדירות המעי בתאי מעיים אנושיים, כמו גם את מודל נמטודות C. אלגיה19.
במחקר זה, השתמשנו בשלושה תנאים ניסיוניים שונים. ראשית, מדדנו את ההשפעות של החיידקים השונים, P. aerginosa ו -E. faecalis, על חדירות מעיים (איור 1). שנית, מדדנו את ההשפעות של P. aeruginosa בשידור חי וחום על חדירות המעי (איור 2). שלישית, מדדנו את ההשפעות של הדים (מודל כימי) על חדירות המעיים של ס. ל. פ . (איור 3).
מטרת מחקר זה היתה לפתח פרוטוקולים ממוטבים המודדים את חדירות המעיים של ה -C. אלגיה, אשר משתנה על ידי טיפול עם חיידקים מעיים שונים, כמו גם עם כימיקלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
על ידי ניצול השיטה החדשה הזאת לקביעת חדירות הבטן ב -C. אלגיה, המשלבת מיקרוסקופית קרינה אוטומטית וניתוח דימוי כמותי, ניתן לקבוע את ההבדלים הנגרמים על-ידי מיקרואורגניזמים או כימיקלים בvivo, במיוחד במעיים של מעיים. פרוטוקול זה שימושי עבור חקירות המעיים והחלים על משימות רבות, כגון מיני …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי מכון קוריאה של מדע וטכנולוגיה מענק מחקר בתחום הציור (2E29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3′-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3′-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3′-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3′-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
