Meten van de effecten van bacteriën en chemicaliën op de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegans
Summary
Dit protocol beschrijft hoe de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegansmeten. Deze methode is nuttig voor fundamenteel biologisch onderzoek naar intestinale gezondheid in verband met de interactie tussen darmbacteriën en hun gastheer en voor screening om te identificeren van probiotische en chemische agentia te genezen van lekkende gut syndroom en inflammatoire darmziekten.
Abstract
In levende organismen is intestinale hyperpermeabiliteit een ernstig symptoom dat leidt tot veel ontstekings darmziekten (Ibd’s). Caenorhabditis elegans is een diermodel van nonzoogdieren dat op grote schaal wordt gebruikt als een testsysteem vanwege de korte levensduur, transparantie, kosteneffectiviteit en gebrek aan ethische problemen met dieren. In deze studie, een methode werd ontwikkeld om te onderzoeken van de effecten van verschillende bacteriën en 3, 3 ‘-diindolylmethane (DIM) op de intestinale permeabiliteit van C. elegans met een hoge doorvoer beeldanalyse systeem. De wormen werden geïnfecteerd met verschillende darmbacteriën of met Dim behandeld voor 48 h en gevoed met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-dextran ‘s nachts. Vervolgens werd de intestinale permeabiliteit onderzocht door de fluorescentie beelden en de intensiteit van de fluorescentie in de worm lichamen te vergelijken. Deze methode kan ook het potentieel hebben om te identificeren van probiotische en pathogene darmbacteriën die invloed hebben op de intestinale permeabiliteit in het diermodel en is effectief voor het onderzoeken van de effecten van schadelijke of gezondheidsbevorderende chemicaliën op intestinale permeabiliteit en intestinale gezondheid. Dit protocol heeft echter ook een aantal aanzienlijke beperkingen op het genetisch niveau, vooral om te bepalen welke genen worden gewijzigd om ziekte te beheersen, omdat deze methode meestal wordt gebruikt voor fenotypische bepaling. Bovendien is deze methode beperkt tot het bepalen van precies welke pathogene ondergronden ontstekingen veroorzaken of de doorlaatbaarheid van de darmen van de wormen verhogen tijdens infectie. Daarom, verdere diepgaande studies, met inbegrip van onderzoek van het moleculaire genetische mechanisme met behulp van mutant bacteriën en nematoden evenals chemische component analyse van bacteriën, zijn vereist voor het volledig evalueren van de functie van bacteriën en chemicaliën bij het bepalen van de intestinale permeabiliteit.
Introduction
Intestinale permeabiliteit wordt beschouwd als een van de belangrijkste barrières in verband met de intestinale microbiota en mucosale immuniteit en is waarschijnlijk worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals gut microbiota modificaties, epitheliale stoornis, of slijm laagwijzigingen1. Recente papers hebben gerapporteerd effectieve protocollen voor het meten van de intestinale permeabiliteit van gekweekte menselijke intestinale cellen door het analyseren van de fluorescentie flux tarieven over de intestinale cel Layer2, maar minder onderzoek papers presenteren een geschikte procedure voor het meten van de darm permeabiliteit in nematoden, met name in C. elegans, met behulp van FITC-dextran kleuring.
Er zijn twee representatieve protocollen voor het meten van de darm permeabiliteit in C. elegans met behulp van Nile Red3 en erioglaucine Dinatrium (of de Smurf assay)4,5. In dit protocol gebruikten we FITC-dextran (gemiddeld molecuulgewicht 10.000), dat een veel hoger molecuulgewicht heeft dan Nijl rood (MW = 318,37) en erioglaucine Dinatrium (MW = 792,85). FITC-dextran is meer vergelijkbaar dan de Nijl rode of erioglaucine dinatriumkleurstoffen aan werkelijke macromoleculaire voedingsstoffen zoals koolhydraten, die worden geabsorbeerd door de intestinale laag. De intestinale permeabiliteit van C. elegans gevoed met erioglaucine Dinatrium(blauwe Smurf kleurstof) kan eenvoudig worden geëvalueerd zonder fluorescentiemicroscopie. Echter, in de Smurf Assay, kwantitatieve analyse van intestinale permeabiliteit is moeilijk te wijten aan het gebrek aan standaardisatie en moet handmatig worden geëvalueerd4,5. In het geval van de Nijl rode Assay, Nile Red ook vlekken lipide druppels in cellen, die kunnen interfereren met de exacte bepaling van de darm permeabiliteit in C. elegans6. De huidige protocollen maken snelle en nauwkeurige kwantitatieve analyse mogelijk van intestinale permeabiliteit in C. elegans behandeld met verschillende intestinale bacteriën en chemicaliën terwijl het vermijden van onspecifieke lipide-kleuring.
C. elegans is een typisch model in biologische gebieden vanwege de betaalbare prijs, eenvoudige manipulatie, beperkte dierlijke ethische kwesties en een korte levensduur, wat gunstig is voor snelle experimenten7. In het bijzonder, nadat de gehele c. elegans genoom werd gepubliceerd, bleek bijna 40% van de genen in de C. elegans genoom orthologous te zijn voor genen die menselijke ziekten8veroorzaken. Bovendien maakt het transparante lichaam observatie in het organisme mogelijk, wat voordelig is voor het onderzoeken van cellulaire gebeurtenissen en voor fluorescentie toepassingen in celbiologie, zoals stamcel kleuring met DAPI of immunohistochemie9. C. elegans wordt vaak gebruikt als een experimenteel dier om de interactie tussen de darm microbiota en de gastheer te bestuderen; Bovendien, C. elegaNS wordt gebruikt voor het scherm gezondheidsbevorderende probiotische bacteriën10,11,12 evenals dieet chemicaliën bevordering van intestinale gezondheid13,14.
Pseudomonas aeruginosa en enterococcus faecalis zijn bekende gut bacteriën die negatieve invloed op het gastro-intestinale systeem, vooral de Colon cellen van het darmkanaal15,16. Daarom, het meten van de darm permeabiliteit veroorzaakt door deze bacteriën is noodzakelijk voor de screening en de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen die kunnen herstellen en de schade veroorzaakt door bacteriële ontsteking en infectie te verminderen. In dit protocol, We testten de effecten van deze intestinale bacteriën op de intestinale permeabiliteit van C. elegans.
We rapporteren ook een geoptimaliseerd protocol voor het testen van chemicaliën op de intestinale permeabiliteit van C. elegans. Voor dit doel, we gebruikten 3, 3 ‘-diindolylmethane (Dim) als een model chemische omdat Dim is een bioactieve metaboliet samengestelde afgeleid van indool-3-carbinol, die aanwezig is in Brassica voedsel planten, en is gemeld dat therapeutische effecten op IBD in muizen17,18. Bovendien, we onlangs ontdekt dat DIM verbetert intestinale permeabiliteit dysfunctie in zowel gekweekte menselijke intestinale cellen, alsmede het model nematode C. elegans19.
In deze studie gebruikten we drie verschillende experimentele condities. Eerst, we gemeten de effecten van de verschillende bacteriën, P. aeruginosa en E. faecalis, op intestinale permeabiliteit (Figuur 1). Ten tweede, we gemeten de effecten van levende en hitte-geïnactiveerd P. aeruginosa op intestinale permeabiliteit (Figuur 2). Ten derde, we gemeten de effecten van DIM (een model chemisch) op de intestinale permeabiliteit van C. elegans gevoed met P. aeruginosa (Figuur 3).
Het doel van deze studie was om geoptimaliseerde protocollen te ontwikkelen die de intestinale permeabiliteit van C. elegansmeten, die wordt gewijzigd door behandeling met verschillende intestinale bacteriën en met chemicaliën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Door gebruik te maken van deze nieuwe methode voor het bepalen van de doorlaatbaarheid van de darmen in C. elegans, die geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse combineert, kunnen de verschillen veroorzaakt door intestinale micro-organismen of chemicaliën in vivo worden bepaald, met name in de darm C. elegans . Dit protocol is nuttig voor onderzoeken van de darm permeabiliteit en toepasbaar op vele taken, zoals het bepalen van reactieve zuurstof soorten (ROS) onder stress…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door een Korea Institute of Science and Technology intramurale Research Grant (2E29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3′-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3′-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3′-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3′-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
