Isolement et expansion des cellules T tueuses cytotoxiques induites par Cytokine pour le traitement du cancer

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour exécuter l’isolement et l’expansion des cellules mononucléaires périphériques mononucléaires CD3^–CD56^– cellules tueuses et pour illustrer leur effet de cytotoxicité contre les cellules cancéreuses hématologiques et solides en utilisant un système de cytométrie de flux de diagnostic in vitro.

Abstract

L’immunothérapie cellulaire adoptive se concentre sur la restauration de la reconnaissance du cancer par l’intermédiaire du système immunitaire et améliore l’abattage efficace des cellules tumorales. La thérapie de cellules T induite par Cytokine (CIK) a été rapportée pour exercer des effets cytotoxiques significatifs contre des cellules cancéreuses et pour réduire les effets défavorables de la chirurgie, de la radiothérapie, et de la chimiothérapie dans des traitements de cancer. CiK peut être dérivé des cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMCs), de la moelle, et du sang de cordon ombilical. Les cellules CIK sont une sous-population hétérogène de lymphocytes T avec cD3^–CD56^– et les caractéristiques phénotypiques du tueur naturel (NK) qui incluent le complexe d’histocompatibilité majeur (MHC) -activité antitumorale sans restriction. Cette étude décrit une méthode qualifiée, cliniquement applicable, basée sur la cytométrie de flux pour la quantification de la capacité cytolytique des cellules CIK dérivées de PBMC contre les cellules cancéreuses hématologiques et solides. Dans l’assay cytolytique, les cellules CIK sont co-incubées à différents rapports avec les cellules tumorales cibles présatyables. Après la période d’incubation, le nombre de cellules cibles est déterminé par une tache liant l’acide nucléique pour détecter les cellules mortes. Cette méthode s’applique à la fois aux applications de recherche et de diagnostic. Les cellules ciK possèdent la cytotoxicité puissante qui pourrait être explorée comme stratégie alternative pour le traitement de cancer sur son évaluation préclinique par une configuration et suivi de cytomètre (CS et T)-basé système de cytométrie de flux.

Introduction

Les lymphocytes T cytotoxiques sont une population spécifique de cellules d’effetmor immunitaire qui médiatise les réponses immunitaires contre le cancer. Plusieurs populations de cellules effectrices, y compris les cellules tueuses activées par la lymphokine (LAK), les lymphocytes infiltrants par tumeur (TL), les cellules tueuses naturelles (NK), les lymphocytes T et les cellules tueuses induites par la cytokine (CIK) ont été développées à des fins de thérapie cellulaire T (ACT)^adoptive1. Il y a un intérêt croissant pour les cellules CIK, parce qu’elles représentent un mélange des populations cytotoxiques cytotoxiques cytokine-induites s’est développée des cellules mononucléaires périphériques autologues de sang (PMBCs)^2.

La croissance incontrôlée des cellules progénitrices lymphoïdes, des myéloblastes et des lymphoblastes mène à trois principaux types de cancers du sang (c.-à-d. leucémie, lymphome et myélome), tumeurs solides, y compris les carcinomes (p. ex. cancer du poumon, cancer gastrique, cancer du col de l’utérus) et sarcomes, entre autres cancers³. Les cellules CIK sont un mélange de populations cellulaires qui présentent un large éventail de complexe d’histocompatibilité majeure (MHC) – activité antitumorale sans restriction et sont donc prometteuses pour le traitement des tumeurs hématologiques et avancées^4,5,6,7. Les cellules CIK comprennent une combinaison de cellules, y compris les lymphocytes T, y compris les lymphocytes T(CD3^etCD56), les cellules NK-T (CD3^etCD56) et les cellules NK (CD3^etCD56). L’optimisation du protocole d’induction CIK par l’utilisation d’un calendrier fixe pour l’ajout d’anticorps IFN, anti-CD3 et IL-2, entraîne l’expansion des cellules CIK⁸. La capacité cytotoxique des cellules de CIK contre des cellules cancéreuses dépend principalement de l’engagement du membre d’un groupe de NK 2 D (un membre de la famille de récepteurs de type C de lectine)NKG2D sur des cellules de tumeur, et sur des voies perforin-négociées^9. Les résultats d’une étude préclinique ont indiqué que les cellules CIK IL-15-stimulées ont induit la cytotoxicité puissante contre les lignes primaires et aigues de cellules de leucémie myéloïde in vitro et ont montré une alloreactivity inférieure contre pbMCs normal et fibroblastes^9. Récemment, les résultats de l’infusion de CIK untemps sain de donneur-dérivé (1 x 10⁸/kg CD3^– cellules) comme consolidation suivant la transplantation allogeneic nonmyeloablative pour le traitement myéloïde de néoplasmes dans une étude clinique de phase II a été édité^10.

Dans la présente étude, nous avons développé une formule optimisée de culture cellulaire composée d’IFN-, d’IL-1, d’anticorps anti-CD3 et d’IL-2 ajoutés au milieu hématopoïétique de cellules pour augmenter la production de CIK, et avons étudié l’effet cytotoxique des cellules de CIK contre le milieu chronique humain cellules de leucémie myéloïde (K562) et cellules de cancer de l’ovaire (OC-3).

Protocol

Le protocole clinique a été exécuté et approuvé conformément aux lignes directrices du Comité d’examen institutionnel de l’Université médicale de Chine et du Comité d’éthique de la recherche hospitalière. Des échantillons de sang périphériques ont été prélevés auprès de volontaires en bonne santé avec leur consentement éclairé. 1. Préparation des matériaux Stockez les réactifs, les anticorps et les produits chimiques comme le montre la fiche de données sur …

Representative Results

Le but du protocole actuel est d’isoler et d’étendre les cellules T de tueur induite par la cytokine (CIK) des monocytes périphériques de sang et d’évaluer l’effet cytotoxique de CIK contre la malignité hématologique et les cellules cancéreuses pleines, respectivement. L’induction de CIK a été identifiée par la reconnaissance CD3/CD56. La figure 1A montre le protocole d’induction et d’expansion du CIK. Les résultats représentatifs de la stratégie de gating pour …

Discussion

La méthode décrite est un protocole rapide, pratique et fiable pour l’isolement et l’expansion des cellules T cytotoxiques induites par la cytokine (CIK) à partir d’échantillons de sang entier de donneurs sains. Il montre également l’effet cytotoxique de CIK contre la leucémie (K562) et les cellules cancéreuses ovariennes (OC-3) à l’aide d’un système de configuration et de suivi de la cytométrie du débit (CS et T). Les cellules CIK peuvent être induites et étendues dans de bonnes pratiques manuusines (GMP) c…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C