Fluorescentie-geactiveerde celsorde voor de isolatie van scleractinische celpopulaties
Summary
Koralen creëren biodiverse ecosystemen die belangrijk zijn voor zowel mensen als mariene organismen. We begrijpen echter nog steeds niet het volledige potentieel en de functie van veel koraalcellen. Hier presenteren we een protocol ontwikkeld voor de isolatie, etikettering en scheiding van steenachtige koraalcelpopulaties.
Abstract
Koraalriffen worden bedreigd als gevolg van antropogene stressoren. De biologische reactie van koraal op deze stressoren kan op cellulair niveau optreden, maar de mechanismen zijn niet goed begrepen. Om de reactie van koraal op stressoren te onderzoeken, hebben we tools nodig voor het analyseren van cellulaire reacties. We hebben met name instrumenten nodig die de toepassing van functionele tests vergemakkelijken om beter te begrijpen hoe celpopulaties reageren op stress. In de huidige studie gebruiken we fluorescentie-geactiveerde celsordening (FACS) om verschillende celpopulaties in steenachtige koralen te isoleren en te scheiden. Dit protocol omvat: (1) de scheiding van koraalweefsels van het skelet, (2) het creëren van een eencellige suspensie, (3) het labelen van de koraalcellen met behulp van verschillende markers voor stroomcytometrie, en (4) gating en celsorling strategieën. Deze methode zal onderzoekers in staat stellen om te werken aan koralen op cellulair niveau voor analyse, functionele testen, en genexpressie studies van verschillende celpopulaties.
Introduction
Koraalriffen zijn een van de belangrijkste ecosystemen op aarde. Ze vergemakkelijken de biodiversiteit door het verstrekken van kritieke habitats voor vissen en ongewervelde dieren en zijn van cruciaal belang voor het behoud van antropogene gemeenschappen door het verstrekken van voedsel en economisch levensonderhoud door middel van toerisme1. Als de belangrijkste bouwer van koraalriffen, het koraal dier (Phylum: Cnidaria) helpt ook kustgemeenschappen door het creëren van grote calcium carbonaat kaders die golf en storm schade te verzachten2.
Koralen als volwassenen zijn sessile dieren die een breed scala van endosymbiotische partners, waaronder virussen, archaea, bacteriën, protisten, schimmels, en vooral, leden van de algen dinoflagellate familie Symbiodiniaceae3host . Veranderingen in het milieu kunnen leiden tot onevenwichtigheden in deze gemeenschap, vaak leidt tot ziekte-uitbraken en koraal bleken waarin de symbiotische Symbiodiniaceae worden verdreven uit de koraalkolonie, waardoor de belangrijkste bron van voeding voor het koraal wordt geëlimineerd. Beide scenario’s veroorzaken vaak de dood van de koraalgastheer4,5,6. Effecten van antropogene geïnduceerde stressoren, zoals snelle klimaatverandering, versnellen de massa koraalsterfte, wat leidt tot een wereldwijde achteruitgang van koraalriffen7.
Onlangs zijn er veel verschillende methoden ontwikkeld om het verlies van koraalriffen te helpen beperken. Deze methoden omvattenoutplanting van koralen op bestaande riffen, genetische kruising met behulp van thermisch tolerante genotypen, en cellulaire manipulatie van de microbiële en symbiotische gemeenschappen gehost binnen het koraal8,9. Ondanks deze inspanningen blijft er veel onbekend over koraalceldiversiteit en celfunctie10,11,12,13. Een grondig begrip van koraalceltypediversiteit en celfunctie is noodzakelijk om te begrijpen hoe het koraalorganisme zich gedraagt onder normatieve en stressvolle omstandigheden. Inspanningen om de efficiëntie van herstel en behoud te maximaliseren, zullen profiteren van een beter begrip van de manier waarop celdiversiteit en genfunctie worden gekoppeld.
Eerdere werkzaamheden over celdiversiteit en -functie waren voornamelijk gericht op histologische studies en RNA-bemonstering met volledig weefsel14,15,16,17. Om meer details te verkrijgen over de specifieke celtypefunctie in koralen, moeten er methoden zijn voor de isolatie van specifieke populaties van levende koraalcellen. Dit is met succes gedaan in niet-klassische modelorganismen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsorting (FACS) flow cytomemetrietechnologie18. FACS maakt gebruik van een combinatie van lasers afgestemd op verschillende golflengten om verschillende endogene cellulaire eigenschappen te meten op het niveau van één cel, zoals relatieve celgrootte, cel granulariteit en autofluorescentie. Bovendien kunnen de cellen worden gemarkeerd door fluorescerende stoffen om specifieke, gewenste eigenschappen18,19te meten .
Tot nu toe is de toepassing van stromingscytometrie op koraalcellen voornamelijk bedoeld geweest voor de analyse van symbiotische Symbiodiniaceae en andere bacteriële populaties door gebruik te maken van hun sterke, natuurlijke autofluorescentie20,21,22. FACS is ook gebruikt om de grootte van het koraalgenoom te schatten door fluorescerend DNA-markersignaal te gebruiken in vergelijking met referentiemodelorganismecellen23,24. De efficiënte toepassing van FACS biedt drie verschillende instrumenten die nuttig zijn voor celbiologiestudies: 1) morfologische en functionele beschrijving van enkele cellen; 2) identificatie, scheiding en isolatie van specifieke celpopulaties voor downstreamstudies; en 3) de analyse van functionele testen op het niveau van één cel.
De ontwikkeling en toepassing van verschillende exogene fluorescerende markers voor de studie van koraalcellen blijft bijna onontgonnen. Dergelijke markers kunnen bestaan uit gelabelde eiwitten, gelabelde substraten voor enzymen of fluorescerende reacties op andere verbindingen. Deze markeringen kunnen worden gebruikt om celtypen te identificeren die unieke eigenschappen hebben, zoals het markeren van cellen die verschillende hoeveelheden van een specifieke cellulaire compartimentfunctie produceren, zoals lysosomen. Een bijkomend voorbeeld is het gebruik van fluorescerend gelabelde kralen om cellen die bevoegd zijn voor fagocytose of het overspoelen van een gerichte ziekteverwekker25functioneel te identificeren. Populaties van cellen die actief zijn in immuniteitsreacties kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door FACS na het overspoelen van deze exogene toegepaste kralen. Terwijl traditionele histologische methoden bewaard weefsel en vele uren nodig hebben om het percentage cellen positief te benaderen voor bead engulfment, kan een op FACS gebaseerde functionele test voor pathogene engulfment relatief snel worden uitgevoerd op geïsoleerde levende cellen. Naast het bestuderen van celspecifieke reacties op stress, heeft deze technologie het potentieel om genspecifieke expressie te verduidelijken en de evolutionaire en ontwikkelingsgeschiedenis van celtypen te verlichten die volledig uniek zijn voor cnidarians, zoals calicoblasten en cnidocyten.
Onlangs hebben we een intensieve screening uitgevoerd van meer dan 30 cellulaire markers die resulteerden in het identificeren van 24 die in staat zijn om koraalcellen te labelen, waarvan er 16 nuttig zijn voor het onderscheiden van uniekepopulaties 18, waardoor ze clusters van differentiatie (CD) zijn. Hier beschrijven we het proces van koraalcelisolatie in Pocillopora damicornis van het verwijderen van cellen uit het calciumcarbonaatskelet tot de identificatie en isolatie van specifieke celpopulaties met FACS (figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol werd aangepast van Rosental et al.18 en ontwikkeld voor de identificatie en isolatie van P. damicornis cellen. De methodologie richt zich op het proces van filteren monsters om puin te verwijderen, niet-levensvatbare cellen, en Symbiodiniaceae gehoste cellen door het onderzoek van cel intrinsieke factoren, met inbegrip van relatieve celgrootte, relatieve cel granulariteit, cel autofluorescentie, en de aanwezigheid van intacte cellulaire membranen. Deze technieken kunnen worde…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTK wil de University of Miami Research Awards in Natural Sciences and Engineering erkennen voor de financiering van dit onderzoek. BR wil Alex en Ann Lauterbach bedanken voor de financiering van het Comparative and Evolutionary Immunology Laboratory. Het werk van BR werd ondersteund door Israel Science Foundation (ISF) nummers: 1416/19 en 2841/19, en HFSP Research Grant, RGY0085/2019. We willen Zhanna Kozhekbaeva en Mike Connelly bedanken voor de technische bijstand. We willen ook de Universiteit van Miami, Miller School of Medicine’s Flow Cytometry Shared Resource bedanken in het Sylvester Comprehensive Cancer Center voor toegang tot de FACS cytometer en aan Shannon Saigh voor technische ondersteuning.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A “nugget of hope” for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. Anatomy. Diseases of Coral. , 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutté, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
