Fluorescensaktiverad cellsortering för isolering av scleractinian cell populationer
Summary
Koraller skapar biologisk mångfald ekosystem viktiga för både människor och marina organismer. Men vi förstår fortfarande inte den fulla potentialen och funktionen hos många korallceller. Här presenterar vi ett protokoll som utvecklats för isolering, märkning och separation av steniga korallcellpopulationer.
Abstract
Korallrev hotas på grund av antropogena stressfaktorer. Den biologiska reaktionen av korall till dessa stressfaktorer kan uppstå på cellnivå, men mekanismerna är inte väl förstådda. För att undersöka korall svar på stressfaktorer, vi behöver verktyg för att analysera cellulära svar. Framför allt behöver vi verktyg som underlättar tillämpningen av funktionella analyser för att bättre förstå hur cellpopulationer reagerar på stress. I den aktuella studien använder vi fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att isolera och separera olika cellpopulationer i steniga koraller. Detta protokoll innehåller: (1) separation av korallvävnader från skelettet, (2) skapandet av en enda cell suspension, (3) märkning korallcellerna med hjälp av olika markörer för flöde cytometri, och (4) gating och cell sortering strategier. Denna metod kommer att göra det möjligt för forskare att arbeta med koraller på cellnivå för analys, funktionella analyser och genuttrycksstudier av olika cellpopulationer.
Introduction
Korallrev är ett av de viktigaste ekosystemen på jorden. De underlättar den biologiska mångfalden genom att tillhandahålla kritiska livsmiljöer för fisk och ryggradslösa djur och är avgörande för att upprätthålla antropogena samhällen genom att tillhandahålla livsmedel och ekonomisk försörjning genom turism1. Som den viktigaste byggaren av korallrev, korall djur (Phylum: Cnidaria) hjälper också kustsamhällen genom att skapa stora kalciumkarbonat ramar som mildrar våg och storm skador2.
Koraller som vuxna är sessile djur som är värd för ett brett spektrum av endosymbiotiska partner, inklusive virus, arkéer, bakterier, protister, svampar, och framför allt, medlemmar av den alg dinoflagellate familjen Symbiodiniaceae3. Förändringar i miljön kan orsaka obalanser i detta samhälle, ofta leder till sjukdomsutbrott och korall blekning där symbiotiska Symbiodiniaceae utvisas från korallkolonin, vilket eliminerar den viktigaste näringskällan för korall. Båda dessa scenarier orsakar ofta död korall värd4,5,6. Effekter av antropogena-inducerad stressfaktorer, såsom snabba klimatförändringar, accelererar massa korall död händelser, vilket leder till en global nedgång av korallrev7.
På senare tid har många olika metoder utvecklats för att lindra korallrev förlust. Dessa metoder inkluderarutplantering av koraller på befintliga rev, genetisk korsning med termiskt toleranta genotyper, och cellulär manipulation av mikrobiella och symbiotiska samhällen värd inom korall8,9. Trots dessa ansträngningar, mycket är fortfarande okänt om korallcell mångfald och cellfunktion10,11,12,13. En grundlig förståelse av korall cell typ mångfald och cellfunktion är nödvändigt att förstå hur korallorganismen beter sig under normativa och stressiga förhållanden. Arbetet med att maximera restaurerings- och bevarandeeffektiviteten kommer att gynnas av en ökad förståelse för hur cellmångfald och genfunktion kopplas ihop.
Tidigare arbete med cellmångfald och cellfunktion har främst fokuserat på histologiska studier och RNA-provtagning i helavävnaden 14,,15,,16,17. För att få mer detaljer om specifika celltyp funktion i koraller, det måste finnas metoder för isolering av specifika populationer av levande korallceller. Detta har gjorts framgångsrikt i icke-klassificerade modellorganismer med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) flödescytometriteknik18. FACS använder en kombination av lasrar inställda på varierande våglängder för att mäta olika endogena cellulära egenskaper på encellig nivå som relativ cellstorlek, cellgranularitet och autofluorescens. Dessutom kan cellerna markeras med fluorescerande märkta föreningar för att mäta specifika, önskade egenskaper18,19.
Hittills har tillämpningen av flödescytometri till korallceller främst varit för analys av symbiotiska Symbiodiniaceae och andra bakteriepopulationer genom att utnyttja deras starka, naturliga autofluorescens20,21,22. FACS har också använts för att uppskatta korallgenomstorlek med hjälp av fluorescerande DNA-markörsignal jämfört med referensmodellorganismcellerna23,24. Effektiv tillämpning av FACS ger tre distinkta verktyg som är användbara för cellbiologi studier: 1) morfologiska och funktionell beskrivning av enskilda celler; 2) Identifiering, separation och isolering av specifika cellpopulationer för studier nedströms; och 3) analys av funktionella analyser på encellig nivå.
Utveckling och tillämpning av olika exogena fluorescerande markörer för studier av korallceller är fortfarande nästan outforskade. Sådana markörer kan innehålla taggade proteiner, taggade substrat för enzymer, eller fluorescerande svar på andra föreningar. Dessa markörer kan användas för att identifiera celltyper som har unika egenskaper, till exempel markera celler som producerar varierande mängder av en specifik cellulär fackfunktion, till exempel lysosomer. Ett ytterligare exempel är användningen av fluorescerande märkta pärlor för att funktionellt identifiera celler som är behöriga för fagocytos, eller uppslukandet av en riktad patogen25. Populationer av celler som är aktiva i immunitet svar kan lätt identifieras av FACS efter uppslukande av dessa exogent tillämpas pärlor. Medan traditionella histologiska metoder kräver bevarad vävnad och många timmar att approximera andelen celler positiva för pärla uppslukande, en FACS-baserad funktionell analys för patogen engulfment kan utföras relativt snabbt på isolerade levande celler. Förutom att studera cellspecifika reaktioner på stress har denna teknik potential att klargöra genspecifika uttryck och belysa celltypernas evolutionära och utvecklingsmässiga historia som är helt unik för cnidarianer, såsom calicoblaster och cnidocyter.
Nyligen utförde vi en intensiv screening av över 30 cellulära markörer som resulterade i att identifiera 24 som kan märka korallceller, varav 16 är användbara för att skilja unika populationer18, vilket gör dem kluster av differentiering (CD). Här beskriver vi processen för korallcell isolering i Pocillopora damicornis från att ta bort celler från kalciumkarbonat skelett till identifiering och isolering av specifika cellpopulationer med FACS (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll anpassades från Rosental et al.18 och utvecklades för identifiering och isolering av P. damicornis celler. Metoden fokuserar på processen att filtrera prover för att ta bort skräp, nonviable celler, och Symbiodiniaceae-hosted celler genom undersökning av cell inneboende faktorer, inklusive relativ cellstorlek, relativ cell granularitet, cell autofluorescens, och förekomsten av intakta cellulära membran. Dessa tekniker kan tillämpas på andra korallarter. FACS-stra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTK vill erkänna University of Miami Research Awards i naturvetenskap och teknik för att finansiera denna forskning. BR vill tacka Alex och Ann Lauterbach för finansieringen av komparativa och evolutionära immunologi laboratory. Arbetet i BR stöddes av Israel Science Foundation (ISF) nummer: 1416/19 och 2841/19, och HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Vi vill tacka Zhanna Kozhekbaeva och Mike Connelly för tekniskt bistånd. Vi vill också tacka University of Miami, Miller School of Medicine’s Flow Cytometry Shared Resource vid Sylvester Comprehensive Cancer Center för tillgång till FACS cytometer och Shannon Saigh för teknisk support.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A “nugget of hope” for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. Anatomy. Diseases of Coral. , 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutté, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
