Skleraktin Hücre Popülasyonlarının İzolasyoniçin Floresan-Aktive Hücre Sıralaması
Summary
Mercanlar hem insanlar hem de deniz canlıları için önemli olan biyoçeşitlilik ekosistemleri oluştururlar. Ancak, hala tam potansiyel ve birçok mercan hücrelerinin fonksiyonu anlamıyorum. Burada, taşlı mercan hücre popülasyonlarının izolasyonu, etiketlemi ve ayrılması için geliştirilmiş bir protokol salıyoruz.
Abstract
Mercan resifleri antropojenik stres nedeniyle tehdit altındadır. Bu streslere mercan biyolojik tepki hücresel düzeyde oluşabilir, ancak mekanizmaları iyi anlaşılamamıştır. Mercanların strese karşı tepkisini araştırmak için hücresel tepkileri analiz etmek için araçlara ihtiyacımız var. Özellikle, hücre popülasyonlarının strese nasıl tepki verdiğini daha iyi anlamak için fonksiyonel tahlillerin uygulanmasını kolaylaştıran araçlara ihtiyacımız vardır. Mevcut çalışmada, taşlı mercanlarda farklı hücre popülasyonlarını izole etmek ve ayırmak için floresan aktive hücre sıralama (FACS) kullanıyoruz. Bu protokol şunları içerir: (1) mercan dokularının iskeletten ayrılması, (2) tek bir hücre süspansiyonunun oluşturulması, (3) mercan hücrelerinin akış sitometrisi için çeşitli belirteçler kullanarak etiketleme sitometrisi ve (4) gating ve hücre sıralama stratejileri. Bu yöntem, araştırmacıların farklı hücre popülasyonlarının analizi, fonksiyonel tahlilleri ve gen ekspresyonu çalışmaları için hücresel düzeyde mercanlar üzerinde çalışmalarına olanak sağlayacaktır.
Introduction
Mercan resifleri dünya üzerindeki en önemli ekosistemlerden biridir. Onlar balık ve omurgasızlar için kritik habitatlar sağlayarak biyolojik çeşitliliği kolaylaştırmak veturizm1 ile gıda ve ekonomik geçim sağlayarak antropojenik toplulukların sürdürülmesi için çok önemlidir. Mercan resifleri anahtar oluşturucu olarak, mercan hayvan (Phylum: Cnidaria) da dalga ve fırtına hasarı azaltmak büyük kalsiyum karbonat çerçeveleri oluşturarak kıyı toplulukları yardımcı olur2.
Yetişkinler gibi Mercanlar virüsler, arkeler, bakteriler, protistler, mantarlar ve en önemlisi, algal dinoflagellate aile Symbiodiniaceae3üyeleri de dahil olmak üzere endosimbiyotik ortakları, geniş bir yelpazede ev sahipliği sessile hayvanlardır. Çevredeki değişiklikler bu toplumda dengesizliklere neden olabilir, genellikle hastalık salgınları ve simbiyotik Simbiyodiniaceae mercan kolonisinden atılır mercan ağartma yol açan, böylece mercan için beslenme önemli kaynağı ortadan kaldırarak. Bu senaryoların her ikisi de genellikle mercan konak4,5,6ölüme neden olur. Antropojenik kaynaklı stres etkileri, hızlı iklim değişikliği gibi, mercan resifleri küresel bir düşüşe yol açan, kitle mercan ölüm olayları hızlandırıyor7.
Son zamanlarda, birçok farklı yöntemler mercan resifi kaybını azaltmak için geliştirilmiştir. Bu yöntemler mevcut resifleri mercan outplanting dahil, termal toleranslı genotipler kullanarak genetik geçiş, ve mikrobiyal ve simbiyotik toplulukların hücresel manipülasyon mercan içinde barındırılan8,9. Bu çabalara rağmen, çok mercan hücre çeşitliliği ve hücre fonksiyonu10,11,,12,13hakkında bilinmemektedir . Mercan hücre tipi çeşitliliği ve hücre fonksiyonu nun tam olarak anlaşılması, mercan organizmasının normatif ve stresli koşullar altında nasıl çalıştığını anlamak için gereklidir. Restorasyon ve koruma verimliliğini en üst düzeye çıkarma çabaları, hücre çeşitliliği ve gen fonksiyonunun nasıl birleştiğinin daha iyi anlaşılmasından yararlanacaktır.
Hücre çeşitliliği ve fonksiyonu üzerinde önceki çalışma öncelikle histolojik çalışmalar ve tam doku RNA örnekleme14, 15,15,16,17odaklanmıştır. Mercanlarda belirli hücre tipi fonksiyonu hakkında daha fazla ayrıntı elde etmek için, canlı mercan hücrelerinin belirli popülasyonlarının izolasyonu için yöntemler olması gerekir. Bu floresan-aktive hücre sıralama (FACS) akış sitometri teknolojisi18ile klasik olmayan model organizmalarda başarıyla yapılmıştır. FACS, göreli hücre boyutu, hücre tanecikliliği ve otofloresans gibi tek hücre düzeyinde farklı endojen hücresel özellikleri ölçmek için değişen dalga boylarına ayarlanmış lazerlerin bir kombinasyonunu kullanır. Ayrıca, hücreler belirli ölçmek için floresan etiketli bileşikler ile işaretlenmiş olabilir, istenen özellikleri18,19.
Şimdiye kadar, mercan hücrelerine akış sitometri uygulaması esas olarak güçlü, doğal otofloresan20,,21,22kullanarak simbiyotik Simbiyodiniaceae ve diğer bakteri popülasyonlarının analizi için olmuştur. FACS ayrıca referans model organizma hücreleri23,24karşılaştırıldığında floresan DNA marker sinyali kullanarak mercan genom boyutunu tahmin etmek için kullanılmıştır. FACS’ın etkin uygulaması hücre biyolojisi çalışmaları için yararlı olan üç farklı araç sağlar: 1) tek hücrelerin morfolojik ve fonksiyonel tanımı; 2) kimlik, ayırma ve downstream çalışmalar için belirli hücre popülasyonlarının izolasyon; ve 3) tek hücre düzeyinde fonksiyonel tahlillerin analizi.
Mercan hücrelerinin incelenmesi için çeşitli eksojen floresan belirteçlerin geliştirilmesi ve uygulanması neredeyse keşfedilmemiş kalır. Bu tür belirteçler etiketli proteinler, enzimler için etiketli substratlar veya diğer bileşiklere floresan yanıtları içerebilir. Bu işaretler, belirli bir hücresel bölmesi özelliğinin farklı miktarlarda üretilmesi gibi benzersiz özelliklere sahip hücre türlerini tanımlamak için kullanılabilir. Buna ek bir örnek, fagositöz için yetkin hücreleri işlevsel olarak tanımlamak için floresan etiketli boncukların kullanılması veya hedeflenen bir patojenin yutulmasıdır 25. Bağışıklık yanıtlarında aktif olan hücre popülasyonları, bu eksojen olarak uygulanan boncukların yutulmasından sonra FACS tarafından kolayca tespit edilebilir. Geleneksel histolojik yöntemler korunmuş doku ve boncuk yutma için pozitif hücrelerin yüzdesini yaklaşık saatlerce gerektirirken, patojen yutma için facs tabanlı fonksiyonel test izole canlı hücreler üzerinde nispeten hızlı bir şekilde yapılabilir. Strese karşı hücreye özgü tepkileri incelemenin yanı sıra, bu teknoloji genlere özgü ifadeyi açıklığa kavuşturma ve kalikoblastlar ve cnidositler gibi cnidarianlara tamamen özgü hücre tiplerinin evrimsel ve gelişimsel tarihini aydınlatma potansiyeline sahiptir.
Son zamanlarda, mercan hücrelerini etiketleme yeteneğine sahip 24 tanımlanması ile sonuçlanan 30’dan fazla hücresel belirteçleri yoğun bir tarama yapıldı, 16 tanesi benzersiz popülasyonları ayırt etmek için yararlıdır18, onları farklılaşma kümeleri yapma (CD). Burada, Pocillopora damicornis’teki mercan hücre izolasyonunun kalsiyum karbonat iskeletinden hücrelerin çıkarılmasından belirli hücre popülasyonlarının FACS ile tanımlanması ve izole edilmesine kadar olan süreci açıklıyoruz (Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol Rosental ve ark.18’den uyarlanmış ve P. damicornis hücrelerinin tanımlanması ve izole edilmesi için geliştirilmiştir. Metodoloji enkaz kaldırmak için örnekleri filtreleme sürecine odaklanır, cansız hücreler, ve Simbiyodiniaceae barındırılan hücreleri hücre içsel faktörlerin incelenmesi yoluyla, göreceli hücre büyüklüğü de dahil olmak üzere, göreceli hücre granüleritliği, hücre otofloresans, ve bozulmamış hücre zarlarının varlığı. Bu t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTK, Bu araştırmayı finanse etmek için Miami Üniversitesi Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Ödülleri’ni kabul etmek istiyorum. BR, Alex ve Ann Lauterbach’a Karşılaştırmalı ve Evrimsel İmmünoloji Laboratuvarı’nı finanse ettiği için teşekkür etmek istiyorum. BR’nin çalışmaları İsrail Bilim Vakfı (ISF) numaraları: 1416/19 ve 2841/19 ve HFSP Research Grant, RGY0085/2019 tarafından desteklenmiştir. Zhanna Kozhekbaeva ve Mike Connelly’e teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Miami Üniversitesi, Miller School of Medicine’s Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Sylvester Kapsamlı Kanser Merkezi’nde FACS sitometre erişim ve Shannon Saigh teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A “nugget of hope” for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. Anatomy. Diseases of Coral. , 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutté, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
