Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen
Summary
Korallen schaffen biodiverse Ökosysteme, die sowohl für Den Menschen als auch für Meeresorganismen wichtig sind. Allerdings verstehen wir immer noch nicht das volle Potenzial und die Funktion vieler Korallenzellen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung, Kennzeichnung und Trennung von Steinkorallenzellpopulationen vor.
Abstract
Korallenriffe sind durch anthropogene Stressoren bedroht. Die biologische Reaktion der Korallen auf diese Stressoren kann auf zellulärer Ebene auftreten, aber die Mechanismen sind nicht gut verstanden. Um die Reaktion von Korallen auf Stressoren zu untersuchen, benötigen wir Werkzeuge zur Analyse zellulärer Reaktionen. Insbesondere brauchen wir Werkzeuge, die die Anwendung von funktionellen Assays erleichtern, um besser zu verstehen, wie Zellpopulationen auf Stress reagieren. In der aktuellen Studie verwenden wir fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um verschiedene Zellpopulationen in Steinkorallen zu isolieren und zu trennen. Dieses Protokoll umfasst: (1) die Trennung von Korallengeweben vom Skelett, (2) die Schaffung einer Einzelzellsuspension, (3) die Kennzeichnung der Korallenzellen mit verschiedenen Markern für die Durchflusszytometrie sowie (4) Gating- und Zellsortierstrategien. Diese Methode wird es Forschern ermöglichen, auf zellulärer Ebene an Korallen für Analysen, funktionelle Assays und Genexpressionsstudien verschiedener Zellpopulationen zu arbeiten.
Introduction
Korallenriffe sind eines der wichtigsten Ökosysteme der Erde. Sie erleichtern die biologische Vielfalt, indem sie kritische Lebensräume für Fische und wirbellose Tiere schaffen, und sind von entscheidender Bedeutung für die Erhaltung anthropogener Gemeinschaften durch die Bereitstellung von Nahrungsmitteln und wirtschaftlicher Existenzgrundlage durch Den Tourismus1. Als wichtiger Erbauer von Korallenriffen unterstützt das Korallentier (Phylum: Cnidaria) auch Küstengemeinden, indem es große Kalziumkarbonatgerüste schafft, die Wellen- und Sturmschäden mildern2.
Korallen als Erwachsene sind sessile Tiere, die eine breite Palette von endosymbiotischen Partnern beherbergen, einschließlich Viren, Archaeen, Bakterien, Protisten, Pilze, und vor allem, Mitglieder der Algendinoflagellate Familie Symbiodiniaceae3. Veränderungen in der Umwelt können zu Ungleichgewichten in dieser Gemeinschaft führen, die oft zu Krankheitsausbrüchen und Korallenbleiche führen, bei denen die symbiotischen Symbiodiniaceae aus der Korallenkolonie vertrieben werden, wodurch die Hauptnahrungsquelle für die Korallen beseitigt wird. Beide Szenarien führen oft zum Tod des Korallenwirts4,5,6. Die Auswirkungen anthropogen-induzierter Stressoren, wie der schnelle Klimawandel, beschleunigen die Massensterben von Korallen, was zu einem globalen Rückgang der Korallenriffe führt7.
In jüngster Zeit wurden viele verschiedene Methoden entwickelt, um den Verlust von Korallenriffen zu mildern. Diese Methoden umfassen die Auspflanzung von Korallen auf bestehenden Riffen, genetische Kreuzung enthäute Genotypen und zelluläre Manipulation der mikrobiellen und symbiotischen Gemeinschaften, die innerhalb derKorallen8,9gehostet werden. Trotz dieser Bemühungen, viel bleibt unbekannt über Korallenzellvielfalt und Zellfunktion10,11,12,13. Ein gründliches Verständnis der Vielfalt und Zellfunktion von Korallenzellen ist notwendig, um zu verstehen, wie sich der Korallenorganismus unter normativen und stressigen Bedingungen verhält. Die Bemühungen, die Wiederherstellungs- und Konservierungseffizienz zu maximieren, werden von einem verbesserten Verständnis der Kopplung von Zellvielfalt und Genfunktion profitieren.
Frühere Arbeiten über Zellvielfalt und Funktion konzentrierten sich in erster Linie auf histologische Studien und Ganzgewebe-RNA-Sampling14,15,16,17. Um mehr Details über die spezifische Zelltypfunktion in Korallen zu erhalten, muss es Methoden für die Isolierung bestimmter Populationen lebender Korallenzellen geben. Dies wurde bei nichtklassischen Modellorganismen mit Hilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortiertechnologie (FACS) erfolgreich durchgeführt18. FACS verwendet eine Kombination von Lasern, die auf unterschiedliche Wellenlängen abgestimmt sind, um verschiedene endogene zelluläre Eigenschaften auf Einzelzellebene zu messen, wie z. B. relative Zellgröße, Zellgranularität und Autofluoreszenz. Zusätzlich können die Zellen durch fluoreszierend markierte Verbindungen gekennzeichnet werden, um spezifische, gewünschte Eigenschaften18,19zu messen.
Bisher war die Anwendung der Durchflusszytometrie auf Korallenzellen hauptsächlich für die Analyse symbiotischer Symbiodiniaceae und anderer Bakterienpopulationen unter Verwendung ihrer starken, natürlichen Autofluoreszenz20,21,22. FACS wurde auch verwendet, um die Größe des Korallengenoms zu schätzen, indem das fluoreszierende DNA-Markersignal im Vergleich zu den Zellen des Referenzmodellorganismus23,24verwendet wurde. Die effiziente Anwendung von FACS bietet drei verschiedene Werkzeuge, die für zellbiologische Studien nützlich sind: 1) morphologische und funktionelle Beschreibung einzelner Zellen; 2) Identifizierung, Trennung und Isolierung spezifischer Zellpopulationen für nachgelagerte Studien; und 3) die Analyse von funktionellen Assays auf Einzelzellebene.
Die Entwicklung und Anwendung verschiedener exogener Fluoreszenzmarker für die Untersuchung von Korallenzellen bleibt nahezu unerforscht. Solche Marker können markierte Proteine, markierte Substrate für Enzyme oder fluoreszierende Reaktionen auf andere Verbindungen umfassen. Diese Marker können verwendet werden, um Zelltypen zu identifizieren, die eindeutige Eigenschaften aufweisen, z. B. das Hervorheben von Zellen, die unterschiedliche Mengen eines bestimmten Zellkompartiment-Features erzeugen, z. B. Lysosomen. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von fluoreszierend gekennzeichneten Perlen zur funktionellen Identifizierung von Zellen, die für die Phagozytose zuständig sind, oder die Verschleierung eines gezielten Erregers25. Populationen von Zellen, die in Immunitätsreaktionen aktiv sind, können von FACS leicht identifiziert werden, nachdem diese exogen aufgetragenen Perlen verschlungen wurden. Während traditionelle histologische Methoden konserviertes Gewebe und viele Stunden benötigen, um den Prozentsatz der Zellen, die positiv für die Perlenverschlangen sind, anzunähern, kann ein FACS-basierter funktioneller Test für die Pathogeneinschließung relativ schnell an isolierten lebenden Zellen durchgeführt werden. Neben der Untersuchung zellspezifischer Reaktionen auf Stress hat diese Technologie das Potenzial, die genspezifische Expression zu klären und die Evolutions- und Entwicklungsgeschichte von Zelltypen zu beleuchten, die für Cnidarier völlig einzigartig sind, wie Calicoblasten und Cnidozyten.
Kürzlich führten wir ein intensives Screening von über 30 zellulären Markern durch, das zur Identifizierung von 24, die Korallenzellen kennzeichnen können, führte, von denen 16 nützlich sind, um einzigartige Populationen18zu unterscheiden, was sie zu Differenzierungsclustern (CD) macht. Hier beschreiben wir den Prozess der Korallenzellisolierung in Pocillopora damicornis von der Entfernung von Zellen aus dem Calciumcarbonat-Skelett bis zur Identifizierung und Isolierung spezifischer Zellpopulationen mit FACS (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wurde von Rosental et al.18 adaptiert und zur Identifizierung und Isolierung von P. damicornis Zellen entwickelt. Die Methodik konzentriert sich auf den Prozess der Filterung von Proben, um Trümmer, nicht lebensfähige Zellen und Symbiodiniaceae-gehostete Zellen durch die Untersuchung von zellinintrinen Faktoren, einschließlich der relativen Zellgröße, der relativen Zellgranularität, der Zellautofluoreszenz und des Vorhandenseins intakter Zellmembranen, zu entfernen….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTK möchte die University of Miami Research Awards in Natural Sciences and Engineering für die Finanzierung dieser Forschung würdigen. Der BR dankt Alex und Ann Lauterbach für die Finanzierung des Comparative and Evolutionary Immunology Laboratory. Die Arbeit des BR wurde von der Israel Science Foundation (ISF) Unterstützt: 1416/19 und 2841/19, und HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Wir danken Zhanna Kozhekbaeva und Mike Connelly für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei der University of Miami, der Flow Cytometry Shared Resource der Miller School of Medicine am Sylvester Comprehensive Cancer Center für den Zugang zum FACS-Zytometer und Shannon Saigh für technische Unterstützung bedanken.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
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