Summary

Коллекция замороженных регионов мозга грызунов для анализа вниз по течению

Published: April 23, 2020
doi:

Summary

Эта процедура описывает сбор дискретных замороженных областей мозга для получения высококачественного белка и РНК с использованием недорогих и общедоступных инструментов.

Abstract

По мере того как наше вникание нейробиологии развивало, молекулярные анализы часто выполняются на малых зонах мозга such as медиальная префронтальная кора (mPFC) или accumbens ядра. Задача этой работы состоит в том, чтобы вскрыть правильную область при сохранении микросреды, которая будет рассмотрена. В этой статье мы описываем простой, недорогой метод с использованием ресурсов, легко доступных в большинстве лабораторий. Этот метод сохраняет нуклеиновой кислоты и белков, сохраняя ткани замороженными на протяжении всего процесса. Мозги разрезают на 0,5-1,0 мм с помощью матрицы мозга и устроены на замороженной стеклянной пластине. Ориентиры в каждом разделе сравниваются со ссылкой, такие как Аллен мышь мозга Атлас, и регионы вскрыты с помощью холодного скальпеля или биопсии удар. Ткань затем хранится при -80 градусах Цельсия до использования. Благодаря этому процессу крыса и мышь mPFC, ядро accumbens, дорсальный и брюшной гиппокамп и другие регионы были успешно проанализированы с помощью qRT-PCR и западных анализов. Этот метод ограничен областями мозга, которые могут быть определены четкими ориентирами.

Introduction

Эта работа иллюстрирует вскрытие замороженных областей мозга для извлечения высококачественной нуклеиновой кислоты или белка с помощью ссылки, такие как Аллен Мышь мозга Атлас1, в качестве руководства. В этом методе мозги замораживаются вспышкой и хранятся при -80 градусов по Цельсию для последующего отделения и вскрытия при сохранении в замороженном состоянии. Этот процесс позволяет исследователю собрать большое количество мозгов за один сеанс, а затем вскрыть их для точного сбора нескольких областей мозга.

Точный сбор областей мозга, представляющих интерес (ROIs) часто требуется при ответе на вопросы, связанные с геном и выражением белка. В то время как фармакология, электрофизиология и оптогенетика могут быть использованы на wildtype или генетически модифицированных грызунов, чтобы помочь прояснить молекулярные изменения, лежащие в основе наблюдаемого поведения2,3,4, измерение индуцированных изменений в транскриптомах и протеом часто используется для поддержки этих выводов. Такие методы, как количественные обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-qPCR), западные blotting, RNAseq5, MAPSeq6 и HPLC7 являются надежными и относительно низкими по стоимости, что позволяет многим лабораториям для изучения индуцированных молекулярных изменений в малых областях мозга2,4,5,6.

Есть несколько способов извлечения и очищения нуклеиновой кислоты или белка из областей мозга8,,9,,10,,11,,12. Многие лаборатории собирают мозг регионов путем охлаждения и резки мозгов на льду во время сбора урожая9,13. Хотя такой подход может привести к высокому качеству нуклеиновой кислоты и белка, он несколько ограничен по времени, поскольку деградация в микроокружении тканей может происходить при таких температурах. Это может быть особенно верно при попытке вскрыть большое количество животных или roIs в один присест. Сохранение образцов замороженных помогает поддерживать молекулы-цели лабила, обеспечивая исследователю время, чтобы тщательно сравнить ориентиры с обеих сторон каждого раздела в попытке собрать относительно чистые образцы. Лазерный захват является еще одним способом сбора ткани для РНК или анализа белка из областей мозга10. Эта процедура превосходит механическое вскрытие в том, что очень маленькие и неправильной формы ROIs могут быть определены и изолированы. Однако лазерный захват ограничен использованием дорогостоящего оборудования и реагентов, занимает много времени, а также может быть более восприимчив к деградации образцов.

Вскрытие микропунда на замороженных тканях не ново. Ранние работы Миклоша Палковича и других подробно описывают основные методы14,,15. Эта презентация в значительной степени соответствует первоначальной работе, с некоторыми улучшениями для облегчения эффективности и сокращения расходов на оборудование, необходимое. Например, участки мозга сделаны в замороженном мозговом блоке, а не на криостате. Это приводит к более толстым секциям, что уменьшает количество секций, необходимых для сбора образцов окупаемое окупаемое инвестиций. Этот метод также вскрывает образцы на замороженной стеклянной пластине, которая сидит на сухом льду в изолированной коробке. Это создает под-замораживания этапе на скамейке, на которой работать. Разделы, расчлененные таким образом, легко манипулируют, что позволяет исследователю сравнивать обе стороны каждого раздела со ссылкой, чтобы ограничить загрязнение из регионов за пределами желаемой рентабельности инвестиций.

Преимущества этого протокола в том, что 1) мозг находится в замороженном состоянии на протяжении всего процесса, что помогает сохранить белок и нуклеиновой кислоты и дает исследователю время, чтобы тщательно собирать ROIs, и 2) реагенты, необходимые являются недорогими и находятся в большинстве лабораторий молекулярной биологии. В этом процессе целые мозги разделены до 0,5-1,0 мм в матрице мозга и помещаются на замороженную стеклянную пластину, которая постоянно охлаждается сухим льдом. Ориентиры, найденные в Атласе мозга Аллена1 или других атласах мозга16,17 используются для выявления областей, представляющих интерес, которые затем вскрыты с помощью либо холодный пунш или скальпель. Поскольку ткань никогда не оттаяла, регионы, собранные таким образом, обеспечивают высокое качество РНК и белка для анализа ниже по течению.

Protocol

К животным, использованным в этом исследовании, относились этически и гуманно, как это предусмотрено Руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных Университета Индианы (IACUC) и Национальными институтами здравоохранения (NIH). ПРИМЕ…

Representative Results

Для того, чтобы проверить этот метод, медиальная префронтальная кора была собрана из взрослых CD1 диких мышей дикого типа и РНК и белка были извлечены и охарактеризованы. РНК была проанализирована с помощью капиллярного электрофорасиса. Деградированная РНК отображает потерю интенсивно…

Discussion

Эта работа описывает метод изолировать небольшие, специфические области мозга, ограничивая деградацию нуклеиновой кислоты и белка. Повреждение тканей мозга происходит быстро, как только организм умирает. Это частично связано с быстрым накоплением внеклеточного глутамата и в результ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH, DA043982 и DA046196.

Materials

0.5 mm Mouse coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 505C Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 705C Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes Dot Scientific 229443 For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-03
4-12% NuPage gel Invitrogen NPO323BOX protein gradient gel
Bioanalyzer System Agilent 2100 RNA analysis system
Dounce tissue grinder Millipore Sigma
D8938
Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite Dolan-Jenner Industries Inc. Model 180 Cool lamp
Glass plates LabRepCo 11074010
HALT ThermoFisher 78440 protease inhibitor cocktail
Low profile blades Sakura Finetek USA Inc. 4689
mouse anti-actin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank JLA20 Antibody
Nanodrop Thermo Scientific 2000C Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade Surgical Design Inc 17467673
Odyssey Blocking buffer LiCor Biosciences 927-40000 Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125 VWR 10046-866 Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody Cell Signaling Technology 94725S Antibody
RNA Plus Micro Kit Qiagen 73034 Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap Life Technologies AM9780
Scalpel handle Excelta Corp. 16050103
Standard razor blades American Line 66-0362
TRIzol Reagent ThermoFisher Scientific 15596026 Used to extract RNA from tissue

References

  1. . Allen Mouse Brain Atlas Available from: https://mouse.brain (2008)
  2. Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
  3. Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
  4. Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).
  5. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  6. Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
  7. Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
  8. Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
  9. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
  10. Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. . Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).
  11. Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
  12. Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
  13. Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
  14. Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
  15. Palkovits, M. . Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).
  16. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).
  17. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).
  18. RNaseZap. Ambion Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ (2008)
  19. . RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ (2016)
  20. Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
  21. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
  22. Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
  23. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
  24. Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
  25. Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008)

Play Video

Citer Cet Article
Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).

View Video