مجموعة من مناطق الدماغ القوارض المجمدة لتحليلات المصب
Summary
يصف هذا الإجراء مجموعة من مناطق الدماغ المجمدة منفصلة للحصول على بروتين عالي الجودة والجيش الملكي النيبالي باستخدام أدوات غير مكلفة ومتاحة عادة.
Abstract
مع تقدم فهمنا لعلم الأحياء العصبية، غالبًا ما يتم إجراء التحليلات الجزيئية على مناطق الدماغ الصغيرة مثل قشرة الجبهية المتوسطة (mPFC) أو النواة. ويتمثل التحدي في هذا العمل في تشريح المنطقة الصحيحة مع الحفاظ على البيئة الجزئية التي يتعين فحصها. في هذه الورقة، نصف طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة باستخدام الموارد المتاحة بسهولة في معظم المختبرات. تحافظ هذه الطريقة على الحمض النووي والبروتينات من خلال الحفاظ على الأنسجة المجمدة طوال العملية. يتم قطع الأدمغة إلى أقسام 0.5-1.0 مم باستخدام مصفوفة الدماغ ويتم ترتيبها على لوحة زجاجية مجمدة. تتم مقارنة المعالم داخل كل قسم بمرجع ، مثل أطلس دماغ ألن ماوس ، ويتم تشريح المناطق باستخدام مشرط بارد أو لكمة خزعة. ثم يتم تخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. من خلال هذه العملية الفئران والفأرmPFC، نواة accumbens، قرن آمون الظهري والبطني ومناطق أخرى قد تم تحليلها بنجاح باستخدام qRT-PCR والمقالات الغربية. وتقتصر هذه الطريقة على مناطق الدماغ التي يمكن تحديدها من خلال معالم واضحة.
Introduction
يوضح هذا العمل تشريح مناطق الدماغ المجمدة لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة أو البروتين باستخدام مرجع ، مثل أطلس دماغ ألن ماوس1، كدليل. في هذه التقنية ، يتم تجميد الأدمغة وتخزينها عند -80 درجة مئوية للتشريح والتشريح في وقت لاحق أثناء الحفاظ عليها في حالة مجمدة. تسمح هذه العملية للباحث بحصاد عدد كبير من الأدمغة في جلسة واحدة ثم تشريحها في وقت لاحق لمجموعة دقيقة من مناطق الدماغ المتعددة.
غالبًا ما يكون الجمع الدقيق لمناطق الدماغ ذات الأهمية مطلوبًا عند الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالتعبير الجيني والبروتيني. في حين يمكن استخدام علم الصيدلة والفيزيولوجيا الكهربائية وعلم الوراثة البصرية على البُرُّب أو القوارض المعدلة وراثياً للمساعدة في توضيح التغيرات الجزيئية التي تقوم عليها السلوكيات الملاحظة2،3،4، غالبًا ما يستخدم قياس التغيرات المستحثة في النصوص والبروتيوملدعم لدعم هذه النتائج. تقنيات مثل كمية عكس النسخ البوليميراز سلسلة التفاعل (RT-qPCR), النشاف الغربي, RNAseq5,MAPSeq6 و HPLC7 قوية ومنخفضة نسبيا في التكلفة, السماح للعديد من المختبرات لدراسة التغيرات الجزيئية المستحثة داخل مناطق الدماغ الصغيرة2,,4,,5,,6.
هناك عدة طرق لاستخراج وتنقية الحمض النووي أو البروتين من مناطق الدماغ8،9،10،11،12. العديد من مختبرات حصاد مناطق الدماغ عن طريق تقشعر لها الأبدان وقطع العقول على الجليد في وقت الحصاد9,13. في حين أن هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى حمض نوي عالي الجودة والبروتين ، إلا أنه محدود زمنيًا إلى حد ما حيث قد يحدث التدهور داخل البيئة الدقيقة للأنسجة في درجات الحرارة هذه. قد يكون هذا صحيحًا بشكل خاص عند محاولة تشريح عدد كبير من الحيوانات أو ROIs في جلسة واحدة. حفظ العينات المجمدة يساعد على الحفاظ على جزيئات الهدف labile مع توفير وقت الباحث لمقارنة بعناية المعالم على جانبي كل قسم في محاولة لجمع عينات نقية نسبيا. التقاط الليزر هو طريقة أخرى لجمع الأنسجة لالحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين من مناطق الدماغ10. هذا الإجراء هو متفوقة على تشريح الميكانيكية في أن يمكن تحديد هاوية صغيرة جدا وغير منتظمة الشكل ومعزولة. ومع ذلك، فإن التقاط الليزر محدود باستخدام المعدات والكواشف باهظة الثمن، وهو يستغرق وقتاً طويلاً وقد يكون أيضاً أكثر عرضة لتدهور العينة.
تشريح Micropunch على الأنسجة المجمدة ليست جديدة. أوراق في وقت مبكر من قبل Miklos Palkovits وغيرها وصف التقنيات الأساسية في التفاصيل14،15. ويتبع هذا العرض إلى حد كبير العمل الأصلي، مع إدخال بعض التحسينات لتيسير الكفاءة وتقليل نفقات المعدات اللازمة. على سبيل المثال، يتم إجراء أقسام الدماغ في كتلة الدماغ المجمدة بدلا من على cryostat. ينتج عن ذلك أقسام أكثر سمكًا مما يقلل من عدد الأقسام اللازمة لجمع عينات عائد الاستثمار. هذا الأسلوب أيضا تشريح عينات على لوحة زجاجية المجمدة التي يجلس على الجليد الجاف داخل مربع معزول. وهذا ينتج مرحلة التجمد الفرعي في مقاعد البدلاء التي للعمل. الأقسام التي يتم تشريحها بهذه الطريقة يمكن التلاعب بها بسهولة ، مما يسمح للباحث بمقارنة كلا الجانبين من كل قسم مع مرجع من أجل الحد من التلوث من المناطق خارج عائد الاستثمار المطلوب.
مزايا هذا البروتوكول هي أن 1) يتم الاحتفاظ الدماغ في حالة المجمدة طوال العملية، مما يساعد على الحفاظ على البروتين والحمض النووي ويعطي الباحث الوقت لحصاد بعناية ROIs، و 2) الكواشف المطلوبة غير مكلفة وتوجد في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية. في هذه العملية، يتم قسمة الأدمغة الكاملة إلى 0.5-1.0 مم في مصفوفة الدماغ ووضعها على لوحة زجاجية مجمدة مبردة باستمرار بالجليد الجاف. المعالم الموجودة في أطلس الدماغ ألن1 أو الأطالس الدماغ الأخرى16,17 وتستخدم لتحديد المناطق ذات الاهتمام, التي يتم تشريحها بعد ذلك إما لكمة الباردة أو مشرط. نظرًا لعدم إذابة الأنسجة أبدًا ، توفر المناطق التي يتم حصادها بهذه الطريقة الحمض النووي الريبي والبروتين عالي الجودة لتحليل المصب.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا العمل تقنية لعزل مناطق صغيرة ومحددة من الدماغ مع الحد من تدهور الحمض النووي والبروتين. الضرر الذي يلحق بأنسجة الدماغ يحدث بسرعة بمجرد وفاة الكائن الحي. ويرجع ذلك جزئيا إلى تراكم سريع من الغلوتامات خارج الخلية وما ينتج عن ذلك من سمية التي تحدث21. رسول الجيش الملكي النيبا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة، DA043982 و DA046196.
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
- . Allen Mouse Brain Atlas Available from: https://mouse.brain (2008)
- Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. . Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. . Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).
- RNaseZap. Ambion Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ (2008)
- . RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ (2016)
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008)
