Aquí presentamos un método robusto y detallado de análisis de dinámica de microtúbulos en células sincronizadas en prometiafase utilizando microscopía confocal de disco giratorio de células vivas y procesamiento de imágenes basado en MATLAB.
Describimos una modificación de un método establecido para determinar la dinámica de microtúbulos en células vivas. El protocolo se basa en la expresión de un marcador codificado genéticamente para los extremos positivos de los microtúbulos (EB3 etiquetado con proteína fluorescente tdTomato) y la imagen de células vivas de alta velocidad y alta resolución mediante microscopía confocal de disco giratorio. La sincronización del ciclo celular y el aumento de la densidad de los microtúbulos se logran mediante la inhibición de la separación centrosómica en células mitoticas, y el análisis del crecimiento se realiza utilizando el software U-Track de código abierto. El uso de una proteína fluorescente brillante y de cambio de rojo, en combinación con la menor potencia láser y el tiempo de exposición reducido necesario para la microscopía de disco giratorio reducen la fototoxicidad y la probabilidad de artefactos inducidos por la luz. Esto permite tomar imágenes de un mayor número de células en la misma preparación mientras se mantienen las células en un medio de crecimiento bajo condiciones de cultivo estándar. Debido a que el análisis se realiza de forma automática supervisada, los resultados son estadísticamente robustos y reproducibles.
Los microtúbulos (MT) son estructuras altamente dinámicas que se encuentran en prácticamente todas las células eucariotas y en algunas bacterias1. Junto con la actina y los filamentos intermedios, esculpen el citoesqueleto2,3. División celular4, transporte de moléculas5, flagelante golpeando6, la sensación del entorno circundante a través del cilium primario7, audición (kinocilium)8,9, embriogénesis10,11,12, invasión y metástasis13,14, e incluso la formación de la memoria15,16,17,18, y muchos otros procesos se basan principalmente en los TM. La participación de los MT en todos estos eventos sería imposible sin su notable capacidad de cambiar rápidamente entre el crecimiento (polimerización) y la contracción (despolimerización). Esta propiedad se describe como inestabilidad dinámica19. La dinámica MT se altera en muchas condiciones patológicas20,21,22. Por lo tanto, determinar la naturaleza de esta propiedad puede ayudar a entender los mecanismos de la enfermedad y posteriormente su tratamiento.
Se ha desarrollado una larga lista de métodos para el análisis de dinámica MT, la mayoría de los cuales se basan en técnicas de imagen23. Inicialmente, se utilizaron microscopios de luz de campo amplio para observar la formación de polímeros de tubulina in vitro24. El descubrimiento de proteínas de unión final (EB) que se acumulan en MT plus-ends y el desarrollo de métodos para etiquetar fluorescentes proteínas hicieron posible observar el comportamiento de los MT directamente en células vivas con microscopios de fluorescencia confocal esdecir de campo ancho y confocal25,26,27. Una proteína EB es proteína de unión final 3 (EB3)28; mediante la sobreexpresión y el seguimiento de EB3 fusionado con una proteína fluorescente, MT plus-end tasas de montaje se pueden determinar29,30.
La microscopía de fluorescencia de escaneo láser confocal (CLSM) se utiliza con frecuencia para seguir la dinámica de MT. Sin embargo, esta técnica de diagnóstico por imágenes supone un alto riesgo de fototoxicidad y fotoblanqueo, dos procesos indeseables para las imágenes de células vivas y muestras tenues31. Con el fin de obtener una mejor relación señal-ruido, la potencia del láser y la duración de la exposición deben ser lo suficientemente altas mientras que no dañan las muestras, y esto requiere sacrificar la resolución a cambio de la velocidad. Una alternativa adecuada a CLSM es la microscopía de disco giratorio32. Esta modalidad de imagen se basa en el uso de un disco Nipkow33,que consiste en un disco en movimiento que lleva una serie de agujeros, y funciona de forma equivalente a muchos microscopios CLS que toma imágenes de la misma muestra simultáneamente34. Por lo tanto, la luz del láser iluminará varias regiones de la muestra simultáneamente, pero conservará la naturaleza confocal. El disco Nipkow, por lo tanto, permite obtener imágenes similares a CLSM pero más rápido y utilizando menos potencia láser. El disco nipkow fue mejorado aún más por Yokogawa Electric, que introdujo un segundo disco con una serie de microlentes que dirigen individualmente la luz en un agujero respectivo, reduciendo aún más la fototoxicidad y el fotoblanqueo35. Por lo tanto, la microscopía de escaneo láser de disco giratorio se convirtió en un método de elección para la creación de imágenes de células en vivo, y permite obtener imágenes con alta relación señal-ruido a una alta velocidad31,36, que es crucial para resolver señales como las de los extremos MT de rápido crecimiento.
La dinámica de MT difiere temporalmente. Por ejemplo, los MT mitoticos son más dinámicos que los interfásicos37,38. Del mismo modo, se han observado diferencias en la tasa de crecimiento y la contracción incluso dentro de la misma fase del ciclo celular, como la mitosis39,40. Por lo tanto, para evitar la recopilación de datos falsos, la medición de la dinámica de MT debe limitarse a una ventana de tiempo estrecha durante el ciclo de celda. Por ejemplo, la medición de la dinámica MT en prometafase se puede lograr mediante el tratamiento de las células con dimetilenasnía (DME), un análogo monastrol que inhibe la quinesina motora Eg541 y evita la formación del husillo mitotico bipolar42. La inhibición de células en prometafase con inhibidor de Eg5 DME y otros derivados monastrolno no afecta a la dinámica MT43,44,45, lo que hace de DME una herramienta útil para el estudio de la dinámica MT tanto en células fijas como vivas44.
Aquí combinamos el método de análisis de dinámica MT en células prometifásicas descrito por Ertych et al.44 con imágenes de disco giratorios duales. Este método permite medir la dinámica de MT en células de prometafase recogidas de un solo plano focal con una mayor tasa de diagnóstico por imágenes, pero sin fotoblanqueo y fototoxicidad mínima. Además, como reportero fluorescente, utilizamos dimer tándem Proteína fluorescente de tomate (tdTomato) que ha mejorado el brillo y la fotoestabilidad en comparación con la proteína fluorescente verde (EGFP) y se excita con menor luz de energía46. Por lo tanto, tdTomato requiere menos potencia láser para la excitación y es menos fototóxico. En conjunto, mejoramos aún más el método reduciendo la fototoxicidad y mejorando la resolución y el postprocesamiento necesarios para el análisis de dinámica MT. Además, creamos una base para futuras modificaciones del método combinándolo con otras técnicas de sincronización.
Aquí, describimos una modificación de un método establecido por primera vez por Ertych et al.44. Junto con varias otras modificaciones, combinamos esta técnica de análisis de dinámica MT con imágenes confocales de disco giratorio dual. El uso del disco giratorio dual mejora la resolución de los TM en crecimiento al tiempo que reduce la fototoxicidad36. Reducimos aún más el fotoblanqueo y el daño inducido por la luz láser de las células cambiando a un reportero …
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los miembros del Light Microscopy Facility, Instituto Max-Planck de Medicina Experimental, por su asesoramiento y apoyo experto.
Dimethylenastron | Merck | 324622 | |
DMEM w/o phenol red | Gibco | 31053-28 | |
DPBS | Gibco | 14190-094 | |
Fetal bovine serum | Biochrom | S0415 | |
Fibronectin Bovine Plasma | Merck | F4759 | Sterile powder |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | Stable glutamine substitutive |
jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
EB3-TdTomato | Addgene | plasmid #50708 | |
RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
Trypan Blue | Merck | T8154-20ML | |
Trypsin/EDTA solution | Biochrom | L2143 | 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium |
µ-slide | Ibidi | 80426 | 4-well slide with #1.5 coverslip |
Eclipse Ti Inverted microscope | Nikon | NA | |
Objective | Nikon | MRD01991 | CFI Apo TIRF 100XC Oil |
ACAL Laser Excahnger | Nikon | Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm | |
Spinning disk module | Andor | CSU-W | |
Camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
Environmental Chamber | Okolab | Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier | |
HeLa Cells | DSMZ | ACC-57 | |
NIS Elements v4 | Nikon | Spinning disk microscope. Acquisition Software | |
MATLAB | Mathworks | Computing environment | |
Prism 8 | GraphPad | Statistical analysis and display software |