İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu
Summary
Burada, fare cremaster kasının post-kılcal venüzlerinde intravital mikroskopinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Yaygın olarak farklı inflamasyon ve sepsis modellerine, özellikle kemokinler ve sitokinler tarafından indüklenenlere uygulanan, abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren muscolopatilerin çalışmasında önemini vurguluyoruz.
Abstract
İntravital mikroskopi (IVM) yaygın olarak lökosit işe kaskad in vivo içinde fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri izlemek için kullanılır. Mevcut protokol, farenin bozulmamış organizması içinde elde edilen iskelet kası dokuda lökosit alımına yol açan lökosit endotel etkileşimini görselleştirmek için pratik ve tekrarlanabilir bir yöntemi temsil eder. Bu model, granülosit aktivasyonuna ve hastalıktaki rollerine odaklanan tüm araştırma alanlarına uygulanabilir.
Yöntemde rehberlik etmek ve olası tuzakları ve teknik zorlukları vurgulamak için adım adım protokol sağlıyoruz. Protokol aşağıdaki hususları kapsamaktadır: deneysel ayarlar ve gerekli malzeme, farenin anestezisi, cremaster kasının diseksiyonu, trakeal ve karotis kanülasyonu, IVM kayıtları ve çevrimdışı analiz. Yapışık lökositler, yuvarlanma akısı (RF) ve yuvarlanma akı fraksiyonu (RFF) gibi veri biçimleri ayrıntılı olarak açıklanmış ve uygun uygulamalar tartışılmıştır. Sonuç bölümünde distrofin eksikliği mdx farelerin indeks sonuçları verilmektedir.
IVM bir in vivo ortamda lökosit işe değerlendirmek için güçlü bir araçtır; ancak, örneğin endotel ve lökosit fonksiyonu için delineating akış odası deneyleri gibi ex vivo kurulumları ile bir kombinasyon gerektirebilir. Ayrıca, ilgi hayvanların genetik arka plan büyük ölçüde sağlanan protokol bireysel ince ayar gerektiren, temel işe etkileyebilir. Sınırlamalarına rağmen, IVM in vitro bulguları yaşayan bir omurgalı organizmaya kolayca çevirmek için bir platform olarak hizmet verebilir.
Introduction
İntravital mikroskopi (IVM) lökosit biyolojisi alanında yaygın olarak uygulanan bir araçtır. Lökosit işe lökosit yakalama tarafından başlatılan iyi tanımlanmış olayların bir çağlayan izler, haddeleme ve endotel duvarına yapışma, ve son olarak transmigration ve inflamasyon gerçek siteye lökosit ekstravazasyon1. Her adım çeşitli kemokinler (örneğin, IL-8/CXCL8), reseptörler (örneğin, LFA-1, Mac-1) ve ilgili endotel hücre adezyon molekülleri (örneğin, ICAM-1, VCAM-1 ve E-Selectin)2,3tarafından aracılık ve kontrol edilir. Farklı düzenleyici sitelerin etkileşimi, kontrol faktörleri ve lökosit işe mediatörleri ileri glisasyon sonu ürünleri (RAGE), hücreler arası adezyon molekülü 1 (ICAM-1), C-X-C motif ligand (CXCL)1/2 ve reseptör CXCR2 ivm4,kullanılarak ortaya çıkarıldı,5,6,7,8,9.
IVM yöntemi bağırsak10gibi birçok farklı organ ve dokular için tarif edilmiştir 10 , deri11, lenf düğümleri12, embriyonik sarısı çuval13 ve diğerleri. Ancak, IVM en yaygın olarak çalışılan yöntem cremaster modeli, ilk sıçanlaraçıklanan 14. Hala sıçanlarda kullanılırken15, yöntem günümüzde ağırlıklı olarak farklı transgenik çizgilerin yüksek bolluğu nedeniyle farelerde uygulanmaktadır. Grubumuz son zamanlarda duchenne Musküler Distrofi (DMD) distrofin eksikliği mdx fareler16çalışma gibi inflamatuar muskolopatiler alanında cremaster IVM potansiyel rolü vurgulamıştır. İnce iç içe geçmiş ve kolayca erişilebilen lif bileşimi sayesinde, cremaster kas ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak bir bütün montaj olarak çalışılması için ideal aday kas temsil eder. Lökosit işe alma ve ekstravazasyon esas olarak post-kılcal venüller yer alır, hangi kolayca cremaster kas sürekli bir kas tabakası üzerinde tespit edilebilir.
In vivo görüntülemenin diğer in vitro tahlillere göre avantajı, canlı bir organizmadaki biyolojik bağlamıdır. Aynı zamanda, değiştirilmiş lökosit işe hücre özel katkıları delineating akış odaları veya endotel tahlilleri gibi ek in vitro modeller gerektirebilir. Birden çok yöntemin birleşimi en ikna edici veri verecektir. Herhangi bir cerrahi manipülasyon artmış lökosit ticareti ve işe yol açacaktır gibi bilim adamları cremaster modelinin sınırlamaları farkında olmalıdır. Bu nedenle, temel işe bu yöntem ile tahmin etmek zordur. Geniş uygulamasına rağmen, cremaster IVM zor olabilir ve yeni bir kurulum kurmak için zaman ve kaynak alabilir. Şimdi IVM bazı yaygın hataları önlemek için yardımcı olacak kolay bir protokol sağlar. Ayrıca, sınırlamalar tartışılacak ve uygun olduğu durumlarda ücretsiz yöntemler vurgulanacaktır.
Kremaster IVM inflamatuar ve enfeksiyöz çalışmalar alanında uygulanacak ideal bir yaklaşım temsil eder. Daha spesifik olarak, cremaster modeli inflamatuar hastalık bağlamında iskelet kas biyolojisi okuyan bilim adamları için yüksek ilgi olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
IvM bir yöntem olarak yaygın olarak farklı organlarda farklı hücre tipleri çalışma için kullanılan ve yaygın olarak tarif edilmiş ve tartışıldı19. Bu çalışmanın temel amacı, cremaster kas ivm kurmak ve gerçekleştirmek için etkili bir yaklaşım sağlamaktır. Yöntemin pratik güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretecektir. Bu nedenle, planlama ve standardizasyon tekniği ana için önemli faktörlerdir. Her şeyden önce, teknik çok yakından izlenmesi ve kontrol edi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) 01GL1746E tarafından PRIMAL Konsorsiyumu’nun bir parçası olarak desteklenmiştir. Yazarlar britta Heckmann ve Silvia Pezer usta teknik yardım için kabul.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
