Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie
Summary
Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.
Abstract
Intravital-Mikroskopie (IVM) ist weit verbreitet, um physiologische und pathophysiologische Prozesse innerhalb der Leukozyten-Rekrutierungskaskade in vivo zu überwachen. Das aktuelle Protokoll stellt eine praktische und reproduzierbare Methode dar, um die Leukozyten-Endothel-Wechselwirkung zu visualisieren, die zu einer Leukozytenrekrutierung im skelettierten Muskelgewebe innerhalb des intakten Organismus der Maus führt. Das Modell gilt für alle Forschungsbereiche, die sich auf die Granulozytenaktivierung und ihre Rolle bei Krankheiten konzentrieren.
Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um die Methode zu durchführen und mögliche Fallstricke und technische Schwierigkeiten aufzuzeigen. Das Protokoll behandelt folgende Aspekte: experimentelle Einstellungen und benötigtes Material, Anästhesie der Maus, Zerlegung des Cremastermuskels sowie Tracheal- und Karotiskannulation, IVM-Aufnahmen und Offline-Analyse. Datenformate wie haftende Leukozyten, Rolling Flux (RF) und Rolling Flux Fraction (RFF) werden ausführlich erläutert und entsprechende Anwendungen diskutiert. Repräsentative Ergebnisse von Dystrophin-Mangel mdx Mäuse nd werden im Ergebnisbereich zur Verfügung gestellt.
IVM ist ein leistungsfähiges Instrument zur Bewertung der Leukozytenrekrutierung in einem In-vivo-Umfeld; Die Abgrenzung z.B. der Endothel- und Leukozytenfunktion kann jedoch eine Kombination mit ex vivo-Setups wie Strömungskammerexperimenten erfordern. Darüber hinaus kann der genetische Hintergrund von Tieren von Interesse die Einstellung von Baselinen stark beeinflussen, was eine individuelle Feinabstimmung des vorgelegten Protokolls erfordert. Trotz seiner Einschränkungen kann IVM als Plattform dienen, um In-vitro-Befunde leicht in einen lebenden Wirbeltierorganismus zu übersetzen.
Introduction
Intravital-Mikroskopie (IVM) ist ein häufig angewandtes Werkzeug auf dem Gebiet der Leukozytenbiologie. Leukozyten Rekrutierung folgt einer Kaskade von genau definierten Ereignissen durch Leukozyten-Capture, Rollen und Adhäsion an der Endothelwand initiiert, und schließlich Transmigration und Extravasation von Leukozyten an die tatsächliche Stelle der Entzündung1. Jeder Schritt wird durch verschiedene Chemokine (z.B. IL-8/CXCL8), Rezeptoren (z.B. LFA-1, Mac-1) und entsprechenden Endothelzelladhäsionsmolekülen (z.B. ICAM-1, VCAM-1 und E-Selectin)2,3. Die Wechselwirkung verschiedener regulatorischer Standorte, Steuerungsfaktoren und Mediatoren der Leukozytenrekrutierungskaskade wie Rezeptor fortschrittlicher Glykationsendprodukte (RAGE), interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1), C-X-C-Motivliganden (CXCL)1/2 und deren Rezeptor CXCR2 wurden mit IVM4,5,6,7,8,9.
Die Methode der IVM wurde für viele verschiedene Organe und Gewebe wie der Darm10, Haut11, Lymphknoten12, der embryonale Dottersack13 und andere beschrieben. Die am weitesten untersuchte Methode von IVM ist jedoch das Cremaster-Modell, das zuerst in Ratten14beschrieben wurde. Während noch bei Ratten15verwendet, wird die Methode heutzutage vor allem bei Mäusen aufgrund der hohen Fülle von verschiedenen transgenen Linien angewendet. Unsere Gruppe hat vor kurzem die mögliche Rolle von Cremaster IVM auf dem Gebiet der entzündlichen Muscolopathien wie Duchenne Muskeldystrophie (DMD) Untersuchung dystrophin-deficient mdx Mäuse16hervorgehoben. Aufgrund seiner dünnen verwobenen und leicht zugänglichen Faserzusammensetzung stellt der Cremaster-Muskel den idealen Kandidatenmuskel dar, der als Gesamtberg mittels Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden kann. Leukozytenrekrutierung und Extravasation finden hauptsächlich in postkapillaren Venulen statt, die leicht auf einer kontinuierlichen Muskelschicht im Cremaster-Muskel identifiziert werden können.
Der Vorteil der In-vivo-Bildgebung im Vergleich zu anderen In-vitro-Assays ist ihr biologischer Kontext in einem lebenden Organismus. Gleichzeitig kann die Abgrenzung zellspezifischer Beiträge zur veränderten Leukozytenrekrutierung zusätzliche In-vitro-Modelle wie Strömungskammern oder endotheliale Assays erfordern. Die Kombination mehrerer Methoden liefert überzeugende Daten. Wissenschaftler sollten sich der Einschränkungen des Cremaster-Modells bewusst sein, da jede chirurgische Manipulation zu einem verstärkten Leukozytenhandel und Rekrutierung führen wird. Daher ist die Einstellung von Baselinen mit dieser Methode schwer abzuschätzen. Trotz seiner breiten Anwendung kann IVM des Cremasters eine Herausforderung sein und ein neuartiges Setup kann Zeit und Ressourcen in Anspruch nehmen. Wir stellen jetzt ein einfaches Protokoll zur Verfügung, das dazu beitragen wird, einige der häufigsten Fehler in IVM zu vermeiden. Außerdem werden Einschränkungen diskutiert und gegebenenfalls kostenlose Methoden hervorgehoben.
IVM des Cremasters stellt einen idealen Ansatz dar, der im Bereich der entzündlichen und infektiösen Studien umgesetzt werden kann. Genauer gesagt, kann das Cremaster-Modell von hohem Interesse für Wissenschaftler sein, die Skelettmuskelbiologie im Kontext von entzündlichen Erkrankungen studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM als Methode wurde weit verbreitet verwendet, um verschiedene Zelltypen in verschiedenen Organen zu studieren und wurde ausführlich beschrieben und diskutiert19. Das Hauptziel dieser Studie ist es, einen effizienten Ansatz zu bieten, um IVM im Cremaster-Muskel einzurichten und durchzuführen. Das Üben der Methode führt zu zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnissen. Daher sind Planung und Standardisierung Schlüsselfaktoren, um die Technik zu beherrschen. Vor allem ist die Technik sehr a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) 01GL1746E im Rahmen des PRIMAL-Konsortiums unterstützt. Die Autoren würdigen Britta Heckmann und Silvia Pezer für geschickte technische Unterstützung.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
