Leukocyte infiltration av Cremaster Muscle hos möss bedöms av intravital mikroskopi
Summary
Här visar vi hur man utför intravital mikroskopi på post-kapillär venules av musen cremaster muskel. Vanligen tillämpas på olika modeller av inflammation och sepsis, särskilt de som induceras av kemokines och cytokiner, vi belysa dess relevans i studien av muscolopathies med överdrivna muskulös leukocyte infiltration.
Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) används ofta för att övervaka fysiologiska och patofysiologiska processer inom leukocyte rekrytering kaskad in vivo. Det nuvarande protokollet representerar en praktisk och reproducerbar metod för att visualisera leukocyte endotel interaktion leder till leukocyte rekrytering i skelettmuskulaturen härrör vävnad inom intakt organismen av musen. Modellen är tillämplig på alla forskningsområden som fokuserar på granulocyteaktivering och deras roll i sjukdom.
Vi tillhandahåller ett steg för steg protokoll för att guida genom metoden och för att belysa potentiella fallgropar och tekniska svårigheter. Protokollet omfattar följande aspekter: experimentella inställningar och nödvändigt material, anestesi av musen, dissekering av cremaster muskel samt trakeal och halspulsådern cannulation, IVM inspelningar och offline analys. Dataformat som vidhäftande leukocyter, rullande flöde (RF) och rullande fluxfraktion (RFF) förklaras i detalj och lämpliga tillämpningar diskuteras. Representativa resultat från dystrofiin bristfälliga mdx möss finns i resultatavsnittet.
IVM är ett kraftfullt verktyg för att bedöma leukocyte rekrytering i en in vivo inställning; Men delineating till exempel endotel och leukocyte funktion kan kräva en kombination med ex vivo inställningar som flöde kammare experiment. Dessutom kan den genetiska bakgrunden hos djur av intresse i hög grad påverka grundläggande rekrytering, vilket kräver individuell finjustering av det protokoll som tillhandahålls. Trots sina begränsningar kan IVM fungera som en plattform för att lätt översätta in vitro-fynd till en levande ryggradsdjur organism.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM) är ett vanligt tillämpat verktyg inom leukocytebiologi. Leukocyte rekrytering följer en kaskad av väldefinierade händelser som initierats av leukocyte fånga, rullande och vidhäftning till endotelväggen, och slutligen transmigration och extravasation av leukocyter till den faktiska platsen för inflammation1. Varje steg medieras och kontrolleras av olika chemokines (t.ex. IL-8/CXCL8), receptorer (t.ex.2,3 Samspelet mellan olika regulatoriska webbplatser, kontrollerande faktorer och medlare av leukocyt rekrytering kaskad som receptor av avancerade glycation slutprodukter (RAGE), intercellulära vidhäftning molekyl 1 (ICAM-1), C-X-C motiv ligand (CXCL)1/2 och deras receptor CXCR2 upptäcktes med IVM4,5,6,77,8,9.
Metoden för IVM har beskrivits för många olika organ och vävnader såsom tarmen10, hud11, lymfkörtlar12, embryonala äggula säck13 och andra. Den mest studerade metoden för IVM är dock cremaster-modellen, som först beskrevs hos råttor14. Även om den fortfarande används hos råttor15,används metoden numera huvudsakligen hos möss på grund av det höga förekomst av olika transgena linjer. Vår grupp har nyligen belyst den potentiella roll cremaster IVM inom inflammatoriska muscolopathies som Duchennes muskeldystrofi (DMD) studera dystrophin-brist mdx möss16. På grund av sin tunna sammanvävd och lättillgänglig fibersammansättning representerar cremastermuskeln den idealiska kandidatmuskeln som ska studeras som ett helt fäste med hjälp av ljus- eller fluorescerande mikroskopi. Leukocyte rekrytering och extravasation sker huvudsakligen i post-kapillär venules, som lätt kan identifieras på en kontinuerlig muskulös lager i cremaster muskeln.
Fördelen med in vivo-avbildning jämfört med andra in vitro-analyser är dess biologiska sammanhang i en levande organism. Samtidigt kan delineating cellspecifika bidrag till förändrad leukocytrekrytering kräva ytterligare in vitro-modeller som flödeskammare eller endotelanalyser. Kombinationen av flera metoder kommer att ge mest övertygande data. Forskare bör vara medvetna om begränsningarna i cremaster modellen som någon kirurgisk manipulation kommer att leda till ökad leukocyte människohandel och rekrytering. Därför är baslinjerekrytering svårt att uppskatta med denna metod. Trots sin breda tillämpning kan IVM av cremaster vara utmanande och en ny inställning kan ta tid och resurser att upprätta. Vi tillhandahåller nu ett enkelt protokoll som kommer att bidra till att undvika några av de vanligaste misstagen i IVM. Dessutom kommer begränsningar att diskuteras och kostnadsfria metoder kommer att belysas där så är tillämpligt.
IVM av cremaster representerar ett idealiskt tillvägagångssätt som skall genomföras inom området inflammatoriska och infektiösa studier. Mer specifikt kan cremaster-modellen vara av stort intresse för forskare som studerar skelettmuskelbiologi i samband med inflammatorisk sjukdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM som metod har använts i stor utsträckning för att studera olika celltyper i olika organ och har beskrivits och diskuterats ingående19. Huvudsyftet med denna studie är att ge ett effektivt tillvägagångssätt för att inrätta och utföra IVM i cremaster muskeln. Öva metoden kommer att ge tillförlitliga och reproducerbara resultat. Planering och standardisering är därför viktiga faktorer för att behärska tekniken. Framför allt är tekniken mycket beroende av hemodynamic och mikrov…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) 01GL1746E som en del av PRIMAL Consortium. Författarna erkänner Britta Heckmann och Silvia Pezer för skickligt tekniskt bistånd.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
