Imaging Dpp Release da un disco ala Drosophila
Summary
La tempistica dell’esposizione ai ligandi può influire sulle loro conseguenze di sviluppo. Qui mostriamo come visualizzare l’immagine di una proteina morfogenetica ossea della Drosophila (BMP) chiamata Dpp dalle cellule del disco alare.
Abstract
La superfamiglia trasformante Growth Factor-beta (TGF-z) è essenziale per il patterning embrionale precoce e lo sviluppo di strutture adulte in organismi multicellulari. La superfamiglia TGF-z comprende la proteina morfogenetica ossea (BMP), gli Activins, i fattori di crescita e differenziazione e i Nodali. È noto da tempo che la quantità di ligando esposto alle cellule è importante per i suoi effetti. Si pensava che i gradienti di concentrazione a lungo raggio fossero un modello embrionale. Tuttavia, recentemente è diventato chiaro che la tempistica dell’esposizione a questi ligandi è importante anche per le loro conseguenze trascrizionali a valle. Un ligando di superfamiglia TGF -z non può avere una conseguenza di sviluppo fino a quando non viene rilasciato dalla cella in cui è stato prodotto. Fino a poco tempo fa, era difficile determinare quando questi ligando sono stati rilasciati dalle cellule. Qui mostriamo come misurare il rilascio di un BMP Drosophila chiamato Decapentaplegic (Dpp) dalle celle del primordium o disco alare. Questo metodo potrebbe essere modificato per altri sistemi o legature di segnalazione.
Introduction
Le proteine morfogenetiche ossee (BMP) sono essenziali per l’embriogenesi precoce e la modellazione di strutture adulte. I BMP sono prodotti e secreti per influenzare la trascrizione dei geni bersaglio necessari per la crescita e la differenziazione cellulare nelle cellule che rispondono. Decapentaplegic (Dpp) è un omologo di Drosophila di BMP4 che è importante per lo sviluppo di strutture embrionali e adulte come l’ala1,2,3,4. Diversi gruppi si sono concentrati sul ruolo del Dpp nel patterning adult ole di mosca perché 1) le ali sono costituite da due fogli di epitelia trasparenti con un modello di venazione coerente che può essere facilmente valutato; 2) i dischi ali sono anche ragionevolmente piatti, possono essere coltivati al di fuori della larva e sono semplici da immaginare e quantificare le differenze di modello; e 3) lo sviluppo del modello alare è sensibile al Dpp in modo tale che piccole perturbazioni nel percorso avranno un impatto sul modello di venazione dell’ala.
Dpp è prodotto in celle situate nel contorno anteriore/posteriore del disco alare5,6,7,8. Dpp si lega a un complesso di tipo 1 e tipo 2 serine / preonina recettori della chinasi9,10. Al momento dell’attacco Dpp, il recettore di tipo 2 fa fosforolaili del recettore di tipo 1 che poi fa fosfolato Madri contro Dpp (Mad), un omologa Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recluta un’ulteriore co-Smad (Medea), che le consente di entrare nel nucleo dove regola i geni bersaglio, portando a effetti a valle come la proliferazione o la differenziazione4,11.
Recentemente, il Bates Lab ha dimostrato che il rilascio improprio di Dpp all’interno del disco alare può portare a una diminuzione del fosfororylazione pazza, alla riduzione dell’espressione genica bersaglio e ai difetti di patterning12,13. Diversi canali ionici influenzano lo sviluppo dell’ala della Drosophila e delle strutture associate14,15. Questi canali ionici potrebbero anche essere coinvolti nel rilascio di Dpp. Nel determinare il meccanismo di rilascio morfogeno, è importante che sia disponibile un metodo per visualizzare gli eventi di rilascio.
I dottori Aurelio Teleman e Stephen Cohen hanno creato una proteina di fusione Dpp-GFP che è in grado di salvare la perdita di Dpp, il che significa che è biologicamente attiva e viene rilasciata in modo biologicamente rilevante16. Qui, descriviamo come visualizziamo gli eventi di rilascio Dpp utilizzando questo Dpp-GFP. Questa proteina di fusione è particolarmente utile perché la GFP è sensibile al pH in modo tale che quando è in vescicoli acidi, la fluorescenza viene spenta17. Pertanto, quando una proteina etichettata con GFP viene rilasciata da una vescica nell’ambiente extracellulare più neutro, l’intensità della fluorescenza GFP aumentadi 17. Abbiamo sfruttato la sensibilità al pH di GFP per determinare se Dpp-GFP risiede in vesciche acide. Abbiamo immaginato dischi alari che esprimono Dpp-GFP prima e dopo l’aggiunta di cloruro di ammonio, che neutralizza i compartimenti intracellulari vescicoli18. Abbiamo trovato un aumento significativo della fluorescenza della puncora dopo l’aggiunta di cloruro di ammonio, suggerendo che il Dpp-GFP intracellulare viene spento prima dell’aggiunta di cloruro di ammonio18. Concludiamo che il Dpp-GFP intracellulare risiede in compartimenti acidi legati alla membrana, come le vescicle, ed è invaloreso dopo l’aggiunta di cloruro di ammonio per neutralizzare il pH dei compartimenti intracellulari18. Questo rende l’imaging live di Dpp-GFP una tecnica utile per visualizzare la dinamica di Dpp nel disco alare della Drosophila quando viene rilasciato dai compartimenti acidi nell’ambiente extracellulare.
Qui descriviamo il metodo che usiamo per visualizzare gli eventi di rilascio Dpp utilizzando Dpp-GFP. Dpp-GFP può essere espresso nel suo modello nativo nei dischi alari della Drosophila utilizzando il sistema UAS-GAL419. Questo è il metodo utilizzato per determinare che i canali Irk influiscono sulla versione18di Dpp. Abbiamo convalidato il metodo con z-stack di imaging live. Non vediamo Puncta Dpp-GFP muoversi all’interno del piano di messa a fuoco in serie temporali se abbiamo acquisito in un piano di messa a fuoco. Inoltre non vediamo il movimento di Puncta Dpp-GFP se abbiamo immagine in uno z-stack. Concludiamo che la puncta Dpp-GFP vista con questo metodo sono eventi di rilascio piuttosto che movimento di vescicoli intracellulare. Questo metodo di imaging live di Dpp-GFP potrebbe essere potenzialmente utilizzato per testare altri modificatori putatti del rilascio di Dpp per il loro impatto sulla dinamica Dpp o potrebbe essere modificato per esaminare le dinamiche di altri ligandi
Protocol
Representative Results
Discussion
BMP come Dpp fanno il loro impatto significativo quando legano un complesso di recettori legati alla membrana per causare una cascata di segnalazione intracellulare nelle cellule vicine o apparentemente lontane. Il laboratorio del Dr. Thomas Kornberg ha dimostrato che le cellule che producono le cellule di contatto del segnale Dpp che ricevono il segnale utilizzando strutture sottili filapodia basate su actin chiamati citonemi15,24,25…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la dott.ssa Sarala Pradhan per aver lavorato su una versione precedente di questo protocollo. Vorremmo ringraziare NSF-IOS 1354282 per il finanziamento mentre abbiamo sviluppato questo protocollo. Ringraziamo NIH-NIDCR RO1DE025311 per aver finanziato il nostro laboratorio.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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