Imaging DPP-release van een Drosophila -vleugel schijf
Summary
De timing van blootstelling aan liganden kan invloed hebben op hun ontwikkelings gevolgen. Hier laten we zien hoe het beeld vrijkomen van een Drosophila bot morfogenetische eiwit (BMP) genaamd DPP uit cellen van de vleugel schijf.
Abstract
De transformerende groei factor-Beta (TGF-β) superfamilie is essentieel voor het vroege embryonale patroon en de ontwikkeling van volwassen structuren in multicellulaire organismen. De TGF-β superfamilie omvat TGF-β, Bone morphogenetische proteïne (BMPs), Activins, groei-en differentiatie factoren, en Nodals. Het is al lang bekend dat de hoeveelheid ligand blootgesteld aan cellen is belangrijk voor de gevolgen ervan. Er werd gedacht dat lange-afstand concentratie gradiënten embryonale patroon instellen. Onlangs is echter duidelijk geworden dat de timing van blootstelling aan deze liganden ook belangrijk is voor hun stroomafwaartse transcriptionele gevolgen. Een TGF-β superfamilie ligand kan geen ontwikkelings consequentie hebben totdat het vrijkomt uit de cel waarin het werd geproduceerd. Tot voor kort was het moeilijk om te bepalen wanneer deze liganden uit cellen werden vrijgelaten. Hier laten we zien hoe de afgifte van een Drosophila BMP met de naam Decapentaplegic (DPP) uit de cellen van de Wing primordium of Wing disc te meten. Deze methode kan worden gewijzigd voor andere systemen of de signalering van liganden.
Introduction
Botmorfogenetische eiwitten (BMPs) zijn essentieel voor de vroege embryogenese en het patroon van volwassen structuren. Bmp’s worden geproduceerd en uitgescheiden om de transcriptie te beïnvloeden van doel genen die nodig zijn voor groei en celdifferentiatie in reagerende cellen. Decapentaplegic (DPP) is een Drosophila homo van BMP4 dat belangrijk is voor de ontwikkeling van embryonale en volwassen structuren zoals de vleugel1,2,3,4. Verschillende groepen hebben zich geconcentreerd op de rol van DPP in patronen Adult Fly Wings omdat 1) de vleugels bestaan uit twee transparante epitheelia vellen met een consistent venatie patroon dat gemakkelijk kan worden beoordeeld; 2) de vleugel schijven zijn ook redelijk plat, kunnen worden gekweekt buiten de larve, en zijn eenvoudig te beeld en kwantificeren verschillen in patroon; en 3) de vleugel patroon ontwikkeling is gevoelig voor DPP zodanig dat kleine verstoringen in het traject van invloed zijn op het vleugel nerven patroon.
DPP wordt geproduceerd in cellen die zich in de voorste/achterste grens van de vleugel schijf5,6,7,8bevinden. DPP bindt aan een complex van type 1 en type 2 serine/Threonine kinase receptoren9,10. Bij DPP binding, de type 2-receptor fosforyleert de type 1-receptor die vervolgens fosforyleert moeders tegen DPP (MAD), een smad 1/5/8 homolog. Gefosforyleerd SMAD rekruteert een extra co-smad (Medea), die het mogelijk maakt om naar de Nucleus te gaan waar het doel genen reguleert, wat leidt tot downstream effecten zoals proliferatie of differentiatie4,11.
Onlangs heeft het Bates-laboratorium aangetoond dat de onjuiste afgifte van DPP binnen de vleugel schijf kan leiden tot een afname van de Mad fosforylering, vermindering van de doel-genexpressie en vleugel patronen van defecten12,13. Verschillende ionenkanalen beïnvloeden de ontwikkeling van de Drosophila vleugel en bijbehorende structuren14,15. Deze ionenkanalen kunnen ook worden betrokken bij de DPP-release. Bij het bepalen van het mechanisme van de morfogen release is het belangrijk dat er een methode is om vrijgave gebeurtenissen te visualiseren.
Drs. Aurelio Teleman en Stephen Cohen creëerde een DPP-GFP fusie-eiwit dat in staat is om verlies van DPP te redden, wat betekent dat het biologisch actief is en wordt vrijgegeven op een biologisch relevante manier16. Hier beschrijven we hoe we DPP release Events visualiseren met behulp van deze DPP-GFP. Dit fusie-eiwit is vooral nuttig omdat GFP pH-gevoelig is, zodat wanneer het in zure blaasjes is, de fluorescentie17wordt geblust. Daarom, wanneer een eiwit gelabeld met GFP is vrijgelaten uit een blaasje in de meer neutrale extracellulaire omgeving, GFP fluorescentie intensiteit stijgt17. We maakten gebruik van de pH-gevoeligheid van GFP om te bepalen of DPP-GFP zich in zure blaasjes bevindt. We afbeelding gemaakt vleugel schijven uitdrukken DPP-GFP voor en na de toevoeging van ammoniumchloride, die neutraliseert intracellulaire compartimenten blaasjes18. We vonden een significante toename van de fluorescentie van puncta na de toevoeging van ammoniumchloride, wat suggereert dat intracellulaire DPP-GFP wordt opge-blust vóór de toevoeging van ammoniumchloride18. We concluderen dat intracellulaire DPP-GFP zich in zure membraan-gebonden compartimenten bevindt, zoals blaasjes, en wordt ongeblust bij toevoeging van ammoniumchloride om de pH van intracellulaire compartimenten18te neutraliseren. Dit maakt live beeldvorming van DPP-GFP een bruikbare techniek om de dynamiek van DPP in de Drosophila-vleugel schijf te visualiseren, omdat deze uit zure compartimenten in de extracellulaire omgeving wordt vrijgegeven.
Hier beschrijven we de methode die we gebruiken om DPP-release-gebeurtenissen te visualiseren met behulp van DPP-GFP. DPP-GFP kan worden uitgedrukt in het oorspronkelijke patroon in Drosophila vleugel schijven met behulp van het UAS-GAL4 systeem19. Dit is de methode die werd gebruikt om te bepalen dat IRK kanalen invloed DPP release18. We hebben de methode gevalideerd door Live-Imaging z-stacks. We zien niet DPP-GFP puncta verplaatsen binnen het vlak van focus in time series als we in één vlak van focus verworven. We zien ook geen beweging van DPP-GFP puncta als we in een z-stack hebben gefotografeerd. We concluderen dat de DPP-GFP puncta gezien met behulp van deze methode release-gebeurtenissen in plaats van beweging van blaasjes intracellularly. Deze methode van Live-Imaging van DPP-GFP kan mogelijk worden gebruikt voor het testen van andere putatieve modifiers van DPP vrijlating voor hun impact op DPP dynamiek of kan worden aangepast om te kijken naar de dynamiek van andere liganden
Protocol
Representative Results
Discussion
BMPs zoals DPP maken hun aanzienlijke impact wanneer ze een complex van membraan gebonden receptoren binden aan een cascade van intracellulaire signalering in naburige of schijnbaar verre cellen veroorzaken. Het lab van Dr. Thomas Kornberg heeft aangetoond dat cellen die de DPP-signaal contact cellen produceren die het signaal ontvangen met behulp van actine-gebaseerde dunne filapodia-achtige structuren genaamd cytonemes15,24,25…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Sarala Pradhan bedanken voor het werken aan een eerdere versie van dit protocol. We willen NSF-IOS 1354282 bedanken voor de financiering terwijl we dit protocol ontwikkelden. We willen NIH-NIDCR RO1DE025311 bedanken voor het financieren van ons lab op dit moment.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Génétique. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Biologie du développement. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch–neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
