Imagem Dpp Liberação de um disco de asa drosophila
Summary
O momento da exposição a ligantes pode afetar suas conseqüências de desenvolvimento. Aqui mostramos como a liberação de imagem de uma proteína morfogenética óssea Drosophila (BMP) chamada Dpp das células do disco da asa.
Abstract
A superfamília transformadora Fator de Crescimento-beta (TGF-β) é essencial para o padrão embrionário precoce e o desenvolvimento de estruturas adultas em organismos multicelulares. A superfamília TGF-β inclui TGF-β, proteína morfogenética óssea (BMPs), Activins, Fatores de Crescimento e Diferenciação e Nodals. Há muito se sabe que a quantidade de ligand expostos às células é importante para seus efeitos. Pensava-se que gradientes de concentração de longo alcance criaram padrão embrionário. No entanto, recentemente, tornou-se claro que o momento da exposição a esses ligantes também é importante para suas conseqüências transcricionais a jusante. Um ligand superfamily de TGF-β não pode ter uma conseqüência desenvolvente até que esteja liberado da pilha em que foi produzido. Até recentemente, era difícil determinar quando esses ligantes eram liberados das células. Aqui mostramos como medir a liberação de um BMP Drosophila chamado Decapentaplegic (Dpp) das células do primordium asa ou disco de asa. Este método pode ser modificado para outros sistemas ou ligantes de sinalização.
Introduction
As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são essenciais para a embriogênese embrionária precoce e o padrão das estruturas adultas. Os BMPs são produzidos e secretados para afetar a transcrição dos genes-alvo necessários para o crescimento e a diferenciação celular nas células de resposta. Decapentapla (Dpp) é um homolog Drosophila de BMP4 que é importante para o desenvolvimento de estruturas embrionárias e adultas como a asa1,2,3,4. Vários grupos se concentraram no papel de Dpp no padrão de asas de mosca adulta saem por 1) as asas são compostas por duas folhas transparentes de epitélia com um padrão de venação consistente que pode ser facilmente avaliado; 2) os discos de asa também são razoavelmente planos, podem ser cultivados fora da larva, e são simples de imagem e quantificar diferenças no padrão; e 3) o desenvolvimento do padrão de asa é sensível a Dpp de tal forma que pequenas perturbações no caminho terá impacto padrão de venação das asas.
Dpp é produzido em células localizadas no limite anterior/posterior do disco de asa5,6,7,8. Dpp se liga a um complexo de receptores de quinase serina/threonina tipo 19,10. Após a ligação Dpp, o receptor tipo 2 fosforiatos o receptor tipo 1 que, em seguida, fosforiatomães contra Dpp (Mad), um smad 1/5/8 homolog. O SMAD fosforilado recruta um co-Smad adicional (Madea), que permite entrar no núcleo onde regula os genes-alvo, levando a efeitos a jusante, como proliferação ou diferenciação4,11.
Recentemente, o Laboratório Bates mostrou que a liberação inadequada de Dpp dentro do disco de asa pode levar a uma diminuição da fosforiação louca, redução na expressão gênica alvo e defeitos de padronização de asa12,13. Vários canais de íons impactam o desenvolvimento da asa drosophila e estruturas associadas14,15. Esses canais de íons também podem estar envolvidos na liberação do Dpp. Ao determinar o mecanismo de liberação de morfogênio, é importante que haja um método para visualizar eventos de liberação.
Drs. Aurelio Teleman e Stephen Cohen criou uma proteína de fusão Dpp-GFP que é capaz de resgatar a perda de Dpp, o que significa que é biologicamente ativo e é lançado de forma biologicamente relevante16. Aqui, descrevemos como visualizamos os eventos de lançamento do Dpp usando este Dpp-GFP. Esta proteína de fusão é particularmente útil porque gfp é pH sensível de tal forma que quando está em vesículas ácidas, a fluorescência é saciada17. Portanto, quando uma proteína marcada com GFP é liberada de uma vesícula para o ambiente extracelular mais neutro, a intensidade da fluorescência gfp aumenta17. Aproveitamos a sensibilidade ao pH da GFP para determinar se o Dpp-GFP reside em vesículas ácidas. Nós imagemddiscos de asa expressando Dpp-GFP antes e depois da adição de cloreto de amônio, que neutraliza compartimentos intracelulares vesículas18. Encontramos um aumento significativo na fluorescência de puncta após a adição de cloreto de amônio, sugerindo que o Dpp-GFP intracelular é saciado antes da adição de cloreto de amônio18. Concluímos que o Dpp-GFP intracelular reside em compartimentos ácidos ligados à membrana, como vesículas, e é insaciável após a adição de cloreto de amônio para neutralizar o pH dos compartimentos intracelulares18. Isso torna a imagem ao vivo do Dpp-GFP uma técnica útil para visualizar a dinâmica do Dpp no disco da asa drosophila, uma vez que é liberado de compartimentos ácidos para o ambiente extracelular.
Aqui, descrevemos o método que usamos para visualizar eventos de lançamento do Dpp usando o Dpp-GFP. Dpp-GFP pode ser expressa em seu padrão nativo em discos de asa Drosophila usando o sistema UAS-GAL419. Este é o método que foi usado para determinar que os canais Irk impacto Dpp liberação18. Validamos o método por meio de imagens ao vivo z-pilhas. Nós não vemos Dpp-GFP puncta movendo-se dentro do plano de foco na série de tempo, se adquirimos em um plano de foco. Nós também não vemos movimento de Dpp-GFP puncta se nós imaged em um z-pilha. Concluímos que o Dpp-GFP puncta visto usando este método são eventos de liberação, em vez de movimento de vesículas intracelularmente. Este método de imagem ao vivo do Dpp-GFP poderia potencialmente ser usado para testar outros modificadores putativos de liberação Dpp por seu impacto na dinâmica Dpp ou poderia ser modificado para olhar para a dinâmica de outros ligantes
Protocol
Representative Results
Discussion
BMPs como Dpp fazer seu impacto significativo quando ligam um complexo de receptores ligados à membrana para causar uma cascata de sinalização intracelular em células vizinhas ou aparentemente distantes. O laboratório do Dr. Thomas Kornberg mostrou que as células que produzem as células de contato com sinal Dpp que recebem o sinal usando estruturas finas de filapodia à base de actina chamadas citonemes15,24,25. Estes dad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Sarala Pradhan por trabalhar em uma versão anterior deste protocolo. Gostaríamos de agradecer ao NSF-IOS 1354282 pelo financiamento enquanto desenvolvemos este protocolo. Gostaríamos de agradecer ao NIH-NIDCR RO1DE025311 pelo financiamento do nosso laboratório atualmente.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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