Summary
Formålet med denne protokol er at detaljere en ny metode til vurdering af segmental hjertefunktion hos embryonale zebrafisk under både fysiologiske og patologiske tilstande.
Abstract
Zebrafisk er i stigende grad udnyttes som en model organisme for kardiomyotiatier og regenerering. Nuværende metoder evaluere hjertefunktion undlader at pålideligt opdage segmentale mekanik og er ikke let muligt i zebrafisk. Her præsenterer vi en halvautomatisk, open source-metode til kvantitativ vurdering af firedimensional (4D) segmental hjertefunktion: forskydningsanalyse af myokardiemekanisk deformation (DIAMOND). Transgene embryonale zebrafisk blev afbildet in vivo ved hjælp af et lysarkfluorescensmikroskopisystem med 4D-synkronisering med hjertemotion. Erhvervede 3D digitale hjerter blev rekonstrueret ved end-systole og end-diastole, og hjertekammer blev manuelt segmenteret i binære datasæt. Derefter blev hjertet omlagt og isotropisk resampled langs den sande korte akse, og hjertekammer var jævnt opdelt i otte portioner (I-VIII) langs den korte akse. På grund af de forskellige resampling-planer og matricer ved end-systole og end-diastole blev der anvendt en transformationsmatrix til billedregistrering for at genoprette den oprindelige rumlige forhold mellem de resamplede systoliske og diatoliciske billedmatricer. Efter billedregistrering blev forskydningsvektoren for hvert segment fra end-systole til end-diastol beregnet på grundlag af forskydningen af massecentroider i tre dimensioner (3D). DIAMOND viser, at basale myokardiesegmenter, der støder op til atrioventrikulær kanalen, gennemgår den højeste mekaniske deformation og er de mest modtagelige for doxorubicin-induceret hjerteskade. Samlet set giver DIAMOND ny indsigt i segmentale hjertemekanik i zebrafisk embryoner ud over traditionelle udslyngning fraktion (EF) under både fysiologiske og patologiske forhold.
Introduction
Kemoterapi-induceret hjertetoksicitet og efterfølgende hjertesvigt er en af hovedårsagerne til kemoterapi seponering1. Derfor spiller hjertefunktionsvurdering en afgørende rolle i identifikationen af hjertetoksicitet og, hvad der er vigtigere, i forudsigelsen af tidlig hjerteskade efter kemoterapi2. Men de nuværende tilgange til hjertefunktionel vurdering støder på begrænsninger. Metoder som venstre ventrikulær udslyngning fraktion (LVEF) giver kun globale og ofte forsinket hjertemekanik efter skade3,4. Væv Doppler billeddannelse giver segmental myokardiedeformation oplysninger, men lider af betydelige intraobservatør og interobserverer variabilitet, dels på grund af ultralyd stråle vinkel afhængighed5. To-dimensionelle (2D) plet sporing udnytter B-tilstand ekkokardiografi, som teoretisk eliminerer vinkelafhængighed, men dens nøjagtighed er begrænset af out-of-plane bevægelse6. Derfor mangler der en streng tilgang til kvantificering af segmenteret hjertefunktion i både forskning og kliniske miljøer.
I denne sammenhæng udviklede vi en 4D-kvantificeringsmetode til analyse af segmental hjertefunktion, som vi kaldte forskydningsanalyse af myokardiemekanisk deformation (DIAMOND), for at bestemme forskydningsvektorerne for myokardiemassecentroider i 3D-rum. Vi anvendte DIAMOND til in vivo vurdering af hjertefunktion og doxorubicin-induceret hjertetoksicitet med zebrafisk(Danio rerio)som dyremodel, valgt på grund af deres regenererende myokardiet og højt bevarede udviklingsmæssige gener7. Vi sammenlignede yderligere segmentale DIAMOND forskydning med global udslyngning fraktion (EF) bestemmelse og 2D stamme efter doxorubicin behandling. Ved at integrere DIAMOND forskydning med 4D lysplade fluorescerende mikroskopi (LSFM) erhvervet rendering af embryonale zebrafisk hjerter, DIAMOND viser, at de basale myokardiesegmenter støder op til den atrioventrikulære kanalen gennemgå den højeste mekaniske deformation og er de mest modtagelige for akut doxorubicin hjerteskade8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af UCLA Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af UCLA Office of Animal Research.
1. Avl Tg(cmlc2:mCherry) zebrafisk og indsamling af embryoner
- Følg procedurerne for indsamling af boliger, avl og embryon som beskrevet i tidligere etablerede opdræts- og avlsmetoder. For yderligere oplysninger, se Messerschmidt et al.9.
- Behandl de indsamlede embryoner med 0,003% 1-phenyl-2-thiourea (PTU) i E3 medium 18 h postfertilisering for at opretholde gennemsigtigheden af embryoner til LSFM-billeddannelse.
2. Doxorubicin behandling for at fremkalde hjerteskade
- Ved 3 dages postbefrugtning (dpf) behandles embryonerne med doxorubicin i en koncentration på 10 μM i E3 fiskevandsmedium. Efter en 24 timers behandling til 4 dpf skal doxorubicinmediet udskiftes med frisk E3-medium.
FORSIGTIG: Doxorubicin er en kemoterapi medicin. Der kræves passende personlige værnemidler, og affaldet skal bortskaffes i beholdere med biofarligt affald.
3. Notch vej graduering
- Behandl zebrafiskembryoner med Notch pathway-hæmmeren (2S)-N-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycin 1,1-dimethylethylester (DAPT) ved en koncentration på 10 μM i E3 fiskevandsmedium fra 3-6 dpf.
- Microinject notch downstream effektorer Hak intracellulære domæne (NICD) og Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA i koncentrationer på 10 pg / nL og 5 pg / nL, henholdsvis i 1-celle fase zebrafisk embryoner8,10.
BEMÆRK: Mikroinjektionen udføres under et mikroskop med støtte fra en luftpumpe for nøjagtigt at styre det injicerede volumen. MRNA mikroinjektion i cellen sker, når det befrugtede æg er på den første cellefase. For nærmere oplysninger om forberedelse og sekvens af mRNAs, se Chen et al.8. For nærmere oplysninger om mikroinjektion og forberedelse af injektionsnåle, se Rosen et al.10.
4. LSFM-billeddannelse og synkronisering efter billeder
- For LSFM billeddannelse teknikker og post-imaging synkronisering algoritme, se detaljer i tidligere publikationer9,11.
BEMÆRK: Kort, vores system udnytter en kontinuerlig-bølge laser som belysning kilde til at billedet alle transgene zebrafisk linjer. Detektionsmodulet består af to videnskabelige supplerende metaloxidhalvlederkameraer (sCMOS) og to sæt filtre til dual-channel billeddannelse. Detektionsmodulet er vinkelret monteret på belysningsplanet. Hver LSFM-ramme erhverves inden for en eksponeringstid på 20 msek, mens opløsningseffekten i tværsnit er ~0,65 μm, og trinstørrelsen mellem på hinanden følgende rammer er ~2 μm. En 589 nm laser blev brugt til at ophidse mCherry fluorescerende signaler.
5. Rekonstruktion af 3D systolisk og diastolisk hjerte
- Åbn den mappe, der er oprettet af algoritmen til synkronisering af indlæg, og åbn derefter mappen "Output". Vælg midterplanet i hjertet, og indlæs hele mappen i ImageJ. Find den første diastoliske og systoliske fase, og optag rammenummeret.
- Åbn mappen "Output/Efter stat", og find de mapper, der har de samme numre som de rammenumre, der lige er registreret. Konverter billederne i mappen til 3D TIFF-filer (kodet billedfilformat), og navngiv dem "diastole.tif" og "systole.tif".
6. Segmentering af hjertekammer
- Åbn billedanalysesoftwaren (se Tabel over materialer). Klik på Filer | Åbn data, og indlæs "diastole.tif" og "systole.tif". Angiv voxel-størrelsen i henhold til billeddannelsesindstillingerne.
BEMÆRK: For det anvendte LSFM-system er den typiske voxelstørrelse 0,65 μm x 0,65 μm x 2 μm. - Klik på panelet "SEGMENTERING", og segmenter manuelt hjertekammerdelen af hjertet. Det indbyggede "Threshold"-værktøj, der kan vælge alle områder over en vis intensitet, kan lette denne proces. Hjertekammeret er det tykkere kammer med en stærkere fluorescens.
BEMÆRK: Sørg for at fjerne atrioventrikulær kanalen og udstrømningskanalen i det segmenterede ventrikel, da dette påvirker forskydningsanalysen. - Når segmenteringen er udført, skal du klikke på panelet "Projekt". Højreklik på "diastole. Labels.tif" og "systole. Labels.tif" faner i konsollen, og klik på "Eksporter data som" for at gemme dataene som 3D TIFF-filer.
7. Oprettelse af rektangulære parallelepipeds til billedregistrering
- Kør "prepImage_1.m" i programmeringsmiljøet(se Materialetabel). Åbn "prepImage_1.m" , "ImPath" i linje 5, så mappen indeholder de originale og segmenterede TIFF-filer, og skift "udsnit" i linje 4 til antallet af udsnit af 3D-tif-filerne.
- Når koden er kørt, genererer den fem nye 3D TIFF-filer ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" og "sysLabel200.tif") samt to nye mapper ("resample_dia" og "resample_sys").
8. Resample systoliske og diastoliske 3D hjerter langs den korte akse plan
- Importer alle fem 3D TIFF-filer til billedanalysesoftwaren (se Tabel over materialer).
BEMÆRK: Voxel-størrelsen er uændret. - Gå til multiplanarpanelet. Vælg "diastole_200.tif" som de primære data. Juster X-aksen (den grønne linje i XY-planet) med ventrikelens lodrette lange akse, og juster Z-aksen (den røde linje i YZ-planet) med ventrikelens vandrette lange akse.
BEMÆRK: Den lodrette lange akse bestemmes ved at finde den længste akse, der forbinder spidsen og udstrømningskanalen i XY-planet, og den vandrette lange akse bestemmes ved at finde den længste akse, der forbinder spidsog udstrømningskanalen i YZ-planet. Roter aksen ved at placere markøren for enden af aksen. - Vælg tre tilfældige punkter fra det skrå YZ-plan (det korte akseplan) på en mod uret, og registrer deres 3D-positionskoordinater.
BEMÆRK: Sørg for, at punkterne vælges mod uret. - Gentag trin 8.2 og 8.3 for "systole_200.tif".
- Klik på panelet "PROJEKT". Opret et "Udsnitsobjekt" til "diastole_200.tif" ved at højreklikke på "diastole_200.tif" og søge efter "Udsnit" objekt. Venstre klik på det udsnitsobjekt, der lige er oprettet, og i panelet Egenskaber | Indstillinger, markér "Set Plane" og vælg tre punkter i "Plane Definition". Angiv koordinaterne for de tre punkter fra trin 7.3.
- Gentag trin 8.5 for "systole_200.tif".
BEMÆRK: Det oprettede udsnitsobjekt skal have navnet "Udsnit 2". - Højreklik på "diastole_200.tif", og søg efter "Resample Transformed Image", og opret objektet. Vælg "Udsnit" som "Reference" i panelet Egenskaber, og klik på Anvend. Dette skulle generere et objekt med navnet "diastole_200.transformeret".
- Højreklik "diastole_200.transformerede" og søg efter "Resample" og opret objektet. Vælg "Voxel Size" som "Mode" og skift "Voxel Size" for at være x = 1, y = 1 og z = 1 i panelet Egenskaber.
- Klik på "Anvend". Dette skulle generere et objekt med navnet "diastole_200.resampled". Højreklik på "diastole_200.resampled", og gem den som en 3D TIFF-fil.
- Gentag det samme trin for "diaLabel.tif" og "test.tif". Gem "diaLabel.resampled" og "test.resampled" som 3D TIFF-filer. Gentag det samme trin for "systole_200.tif", "sysLabel.tif" og "test.tif" ved hjælp af "Slice 2" som reference, og gem "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" og "test2.resampled" som 3D TIFF-filer.
BEMÆRK: Sørg for, at der er gemt i alt seks TIFF-filer i dette trin.
9. Opdeling af det resamplede hjerte
- Importer alle seks gensamplede filer fra trin 8 til ImageJ. Vælg et udsnit af "systole_200.resampled", hvor atrioventrikulær kanalen er tydeligt visualiseret. Optag nummeret på udsnittet.
- Brug "Billede | Transformering | Roter" funktionen af ImageJ, så atrioventrikulær kanalen er lodret. Anvend den samme rotation på alle filer. Luk alle vinduer, og gem alle ændringer.
- Flyt "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled" og "test.resampled" til mappen "resample_dia", og flyt "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" og "test2.resampled" til mappen "resample_sys".
- Åben "divider_2_8_pieces.m". Skift "ImPath" i linje 5 og "ImPath" i linje 395 til billedmappen. Skift variablen "Middle" i linje 22 og linje 411 til udsnitsnumrene, hvor atrioventrikulær kanalen tydeligt visualiseres i "systole_200.resampled" og "diastole_200.resampled".
- Kør koden, og i de besøgte vinduer klik én gang i midten af hjertekammer og klik én gang i midten af atrioventrikulære kanalen. Dette skal gøres to gange for både systole og diastole billeder.
10. Registrering af systoliske og diastoliske billedmatricer
- Åbn "register_3.m", og skift "ImPath" i linje 4 til billedmappestien. Det kan tage 5-20 minutter at køre denne kode afhængigt af systemets beregningseffekt.
BEMÆRK: De kunstigt skabte rektangulære parallelepibeider i trin 7 bruges til 3D stiv registrering, der bevarer afstanden mellem to punkter og vinkler tegnet med tre punkter. Når end-diastole rektangulære parallelepiped (rød) er registreret til end-systole rektangulære parallelepiped (grøn), den efterfølgende discrepant 3D placering tillader afledning af en unik matrix af stiv transformation bestående af rotation og oversættelse fra end-diastole matrix til end-systole matrix(figur 1H). Vi udfører registreringen og legaliseret energi minimering at lægge mærke til matrix en efter transformation ved hjælp af en billedbehandling værktøjskasse (se Tabel over materialer). For en detaljeret matematisk beskrivelse, se chen et al.8.
11. Udfingen af forskydningsvektorerne
- Åbn "displacement_4.m" og skift "ImPath" i linje 4 til billedmappestien.
- Kør "displacement_4.m", som genererer en "vector8.txt" fil i mappen "vektorer". Når filen "vector8.txt" er åben, vil der være en 8 x 4 matrix. Hver række i matrixen har fire tal, som er størrelsen af X-komponenten, Y-komponenten, Z-komponenten og SUM-størrelsen af forskydningsvektoren for et bestemt segment af hjertekammer.
BEMÆRK: Forskydningsvektoren opnås ved beregning af forskydningen af massecentroiden for hvert segment i 3D-rummet. Vi beregner 3D massecentroid (PS og
PD)koordinater (hvor k angiver henholdsvis X, Y eller Z) for hvert segment (I-VI) i segmenteringsdatasættet fra systole til diastole ( figur1J). Vi definerer masscentroid i 3D-rummet som følger:
hvor Cx = X, Cy = Y og Cz = Z, Mi = massen af hvert segment (I ≤ i ≤ VI), m = antallet af voxels i hvert segment og ρ = tæthedsfunktionen som det segmenterede område er 1, mens resten er 0. L2-normen for sub-forskydningvektorer langs X-, Y-, og Z-akser og sum forskydning vektor beregnes under hjertecyklus. Der er i alt otte rækker i matrixen. Den første række og den ottende række indeholder atrioventrikulær kanalen og ignoreres således i vores analyse. Segment I til VI repræsenteres af den anden række til den syvende række.
PD)koordinater (hvor k angiver henholdsvis X, Y eller Z) for hvert segment (I-VI) i segmenteringsdatasættet fra systole til diastole ( figur1J). Vi definerer masscentroid 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den proces, hvorved DIAMOND blev udviklet til vurdering af 3D-segmenthjertesygdom, præsenteres i figur 1. Efter LSFM-billederhvervelse og rekonstruktion i 3D af embryonale zebrafiskhjerte(figur 1A)blev det sande kortakseplan bestemt som plan vinkelret på de lodrette og vandrette lange akser, som begge bestemmes i en flerplanfremviser (figur 1B). Hjertet blev derefter resampled langs den korte akse plan(Figur 1C),og opdelt i otte lige segmenter består af lige vinkler i henhold til en virtuel division linje (rød stiplet linje) forbinder midten af endokardialvenskab hulrum til midten af atrioventrikulære kanalen(Figur 1E). 3D-afbildningerne af de identificerede segmenter illustreres i et tværsnitsperspektiv (figur 1F) og i sammenligning med rådata (figur 2). Segment VII og VIII blev fjernet fra analysen, fordi de omfatter atrioventrikulær kanalen og dermed indeholder mindre myokardiet sammenlignet med andre segmenter. De forskellige genudtagningsplaner for end-systole (HS)og end-diastole (HD)fører til særskilte koordinatsystemer for end-systoliske og end-diastoliske matricer, som skal registreres for at genoprette deres oprindelige rumlige forhold(figur 1G). Koordinatsystemet for den endesystoliske matrix blev valgt som reference for konsistens. For at bestemme transformationsmatrixen (Tm) fra den ende-diastoliske matrix til den ende-systoliske matrix, en matrix af tre parallelepipeds, som er asymmetrisk i 3D og har samme dimension som den oprindelige billedmatrix, blev næsten skabt. Parallelepipeds blev resampled to gange, først i den korte akse plan af end-systole matrix, og derefter i den korte akse plan af end-diastole matrix, hvilket fører til forskellige omdannede parallelepipeds for end-systole (grøn) og end-diastole (rød) (Figur 1H).
De grønne og røde parallelepipeds blev derefter registreret sammen af en stiv kropsregistrering algoritme og Tm blev beregnet og anvendt på end-diastole matrix til at genoprette koordinaterne(figur 1I). Denne proces tillader efterfølgende sporing i 3D-rummet af forskydningsvektorer af massecentroider fra ethvert segment af hjertekammer under hjertecyklussen (figur 1J). DIAMOND forskydning af ventrikelsegmenter I-VI kan spores i flere tidspunkter i hjertecyklussen (figur 1K), som kan forenkles til kvantitativ analyse til to tidspunkter lige fra endestoli til end-diastole (figur 1L). De segmenter, der genereres af DIAMOND, kan visualiseres i figur 2, hvor hver farve repræsenterer ét hjertesegment.
Med DIAMOND, vi afdækket segmental heterogenitet af hjertefunktion og modtagelighed for doxorubicin-induceret myokardieskade i zebrafisk. Efter en 24 timers behandling med 10 μM doxorubicin fra 3-4 dpf (figur 3A) sammenlignede vi DIAMOND-forskydning en ventrikulær segmenter mellem kontrol- og kemoterapibehandlede grupper (figur 3B) og 48 timer efter behandling (figur 3C). Alle DIAMOND-figurer følger samme grafiske mønster som de resamplede hjertekamre langs den korte akse (figur 1E). Dataene præsenteres som procenter ved at normalisere L2-normen for forskydningsvektoren til hjertets indre omkreds, med X (grøn), Y (blå) og Z-komponenter (orange) illustreret som deres vægtede bidrag. Ved 4 dpf varierede den gennemsnitlige L2-norm for segmentisme forskydningsvektorer i kontrolfisk fra 6,6-11,3 μm eller 3,8-6,6% efter normalisering. Vores resultater viser, at under kontrolbetingelser gennemgår de basale segmenter I og VI de største forskydninger og er dem, der er mest modtagelige for doxorubicin induceret hjerteskade(figur 3B, 29% fald fra 6,6-4,7%, n = 10 kontrol og n = 8 doxorubicin, p < 0,01). Ved 6 dpf varierede den gennemsnitlige L2-norm for segmentisme forskydningsvektorer i kontrolfiskene fra 6,8-14 μm eller 3,9-8% efter normalisering. Ved 6 dpf genvandt de basale segmenter I og VI DIAMANTforskydning til kontrolniveauer, hvilket tyder på segmental regenerering (Figur 3C, n = 10 kontrol og n = 8 doxorubicin). Parallelt hermed blev der observeret en forværring af 2D-basalbelastningen fra -53 til -38 % ved 4 dpf efter doxorubicinbehandling efterfulgt af en tilbagevenden til kontrolniveauer ved 6 dpf, hvilket underbygger diamantforskydningsresultaterne (figur 3D, 3E). Der blev også observeret et parallelt fald i den globale udslyngningsfraktion som reaktion på doxorubicin ved 4 dpf med restitution ved 6 dpf (figur 3F, 3G).
Vi næste anvendt DIAMOND under doxorubicin behandling og Notch vej graduering ved hjælp af Notch hæmmer DAPT og redning ved hjælp af Notch downstream effektorer NICD og NRG1 mRNA(Figur 4A). NICD og NRG1 mRNA mikroinjektion reddede faldet i DIAMOND forskydning og EF efter akut kemoterapi-induceret skade ved 4 dpf (Figur 4B, 4D). Eksponering for Notch-hæmmeren DAPT sammen med doxorubicin førte til et mere diffust fald i DIAMANTforskydning, ud over de basale segmenter I og VI (Figur 4B). Desuden hæmmede hæmningen af Notch-vejen efter kemo-induceret skade yderligere genvindingen af DIAMOND-forskydningen af basalsegmenterne og EF ved 6 dpf. Hæmningen blev reddet af Notch downstream-effektorerne NICD og NRG1 (Figur 4C, 4E).
Figur 1: Udvikling af 4D DIAMOND-forskydning. (A) Rå billeder blev taget af lys-ark fluorescerende mikroskopi. (B og C) Rekonstrueret 3D hjerte blev resamplet langs den sande korte akse plan visning. (D) Skematisk illustration af embryonale zebrafisk hjerte. (E og F) 2D- og 3D-illustrationer af opdelingen af ventrikel i otte segmenter undtagen afsnit VII og VIII. (G) De forskellige koordinatsystemer for end-systole og end-diastole efter genprøveudtagning. H) Der blev oprettet en gruppe rektangulære parallelepipeds til generering af en transformationsmatrix (Tm). I) Registrerede end-systoliske og end-diastoliske koordinatsystemer ved anvendelse af Tm. (J) Forskydningvektor af segmentmassecentroid fra end-systoltil end-diastol. (K) DIAMANT forskydning af ventrikelsegmenter I-VI spores i løbet af flere tidspunkter i hjertecyklus. (L) DIAMANT forskydning af ventrikelsegmenter I-VI fra end-systoli til end-diastol. Dette tal fra Chen et al.8 er gengivet med tilladelse fra American Society for Clinical Investigation (ASCI). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: DIAMANTsegmentering af fosterzebrafiskhjertet sammenlignet med rå data i 3D. Den embryonale zebrafisk hjerte blev opdelt i seks segmenter (mængder) afbildet her i forskellige farver til beregning af DIAMOND forskydninger (venstre). Forskydningsvektoren for hvert segment beregnet af DIAMOND repræsenterer dens segmentale hjertefunktion. Atrium og udstrømningskanalen blev fjernet under segmenteringen. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: DIAMOND opklarer den segmentale heterogenitet i hjertefunktion og modtagelighed for kemoterapi-induceret skade. (A) Eksperimentel tidsplan for doxorubicin behandling. (B og C) Segmental sammenligning af DIAMOND forskydningvektorer normaliseret til den indre myokardieomkreds mellem kontrol og doxorubicin-behandlede grupper ved 4 og 6 dpf (t test, **p < 0,01, n = 8-10 per gruppe). (D og E) Vurdering af stammen i ventrikelbasen, der viser et lignende skades- og regenereringsmønster som DIAMANTforskydningsvektorerne (*p < 0,05, n = 6-8 pr. gruppe). (F og G) Fald i udslyngningfraktionsom reaktion på doxorubicin ved 4 dpf med restitution ved 6 dpf efter et mønster svarende til segmentale DIAMANTforskydninger på det globale ventrikelniveau (t-test, **p < 0,01, fejlstænger SEM, n = 6-10 pr. gruppe). Dette tal fra Chen et al.8 er gengivet med tilladelse fra ASCI. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: DIAMOND mekanik til vurdering af Notch-medieret myokardieopsving efter doxorubicin-induceret skade. (A) Eksperimentel tidsplan. (B og C) NICD og NRG1 Notch downstream effektorer reddet reduktion af DIAMOND forskydning i segment I og VI på 4 dpf. Ved 6 dpf forringede dapts hæmning af Notch-signalering genoprettelsen af segmental hjertefunktion (ANOVA, **p < 0,01 Dox vs. kontrol; †p < 0,05, ††p < 0,01, Dox + DAPT vs. kontrol, n = 6-10 pr. gruppe). (D og E) Udslyngning fraktion bekræfter DIAMOND mekanik på globalt plan (ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01, fejl barer SEM, n = 5-11 per gruppe). Dette tal fra Chen et al.8 er gengivet med tilladelse fra ASCI. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En streng strategi for kvantificering af segmental myokardiefunktion er afgørende for at vurdere hjertemekanik ud over traditionel EF, kendt for at være en ufølsom og forsinket indikator for myokardieskade1,4,12. Derfor har der været en stigende interesse for markører for tidlige myokardieændringer, og en voksende mængde af litteratur understøtter myokardiedeformation parametre som en tidlig indikator for at forudsige ventrikulær dysfunktion4,13. Ekkokardiografisk måling af venstre ventrikulær (LV) stamme giver en etableret metode til myokardiedeformation måling13. Men, væv Doppler-baserede stamme imaging lider af en række mangler på grund af vinkel afhængighed og intraobservatør og interobserverer variabilitet14. Speckle tracking ekkokardiografi (STE) kan løse vinkel-uafhængige 2D og 3D væv deformation, men nøjagtigheden af 2D speckle tracking påvirkes af gennem-plan bevægelse6,mens 3D speckle tracking kræver overlegen rumlig opløsning til at løse de positive ultralyd interferens mønstre (pletter) i 3D og høj tidsmæssig opløsning til at spore pletter mellem rammer15. I denne protokol beskriver vi DIAMOND-forskydning som en ny myokardiedeformationsparameter for in vivo-kvantificering af 4D-segmenthjertesygdom hos zebrafisk. Sammenlignet med EF og 2D stamme som referencestandarder, DIAMOND giver yderligere segmentære deformation oplysninger uden at blive påvirket af gennem-plan bevægelse. Ved at integrere DIAMOND med 4D LSFM, kan vores teknik vurdere forskydning vektor af et hjerte segment 20-30 μm i bredden, hvilket i øjeblikket er umuligt for selv de mest avancerede 3D STE system, som har millimeter-range opløsning16.
For at anvende DIAMOND, er det afgørende at have en omfattende forståelse af den anatomiske struktur af embryonale zebrafisk hjerte. Under billedsegmentering er det vigtigt, at atrioventrikulær kanalen og udstrømningskanalen identificeres korrekt og segmenteres fra resten af myokardiet, når brugeren udfører trin 6 i protokollen. Desuden skal ventrikelens vandrette og lodrette lange akser bestemmes nøjagtigt for at udlede det sande korte akseplan for genprøveudtagning af billedet i trin 8.
Den vigtigste hastighedsbegrænsende faktor for anvendelse af DIAMOND er den manuelle segmentering af hjertekammer, som bliver tidskrævende, når flere faser i hjertekredsløbet kan være nødvendigt at evaluere. Med fremme af machine learning og neurale netværk, en automatiseret hjertesegmentering metode17,18,19,20 kunne integreres med DIAMOND til at give overvågning af segmenterede hjertefunktion i hele hjertecyklus. Yderligere anvendelser af DIAMOND omfatter også integration med ekkokardiografi, mikro-CT, eller mikro-MR, egnet i større dyremodeller til multiskala vurdering af hjerteskader og regenerering21. Men metoden vil først kræve tilpasning til tilstedeværelsen af myokardiefibre, der fører til mere komplekse hjertedeformation, herunder torsion hos pattedyr22,23.
Samlet set giver DIAMOND en ny metode til at evaluere segmenteret hjertefunktion hos embryonale zebrafisk under både fysiologiske og patologiske forhold og kan anvendes som platform for høj gennemløb i vivo screening af veje forbundet med kemoterapi-induceret hjertetoksicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklæret, at der ikke er nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Det nuværende arbejde blev finansieret af American Heart Association tilskud 16SDG30910007 og 18CDA34110338, og af National Institutes of Health tilskud HL083015, HL111437, HL118650, og HL129727.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
References
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Thavendiranathan, P., Wintersperger Bernd, J., Scott, F. D., Thomas D, M. H. Cardiac MRI in the Assessment of Cardiac Injury and Toxicity From Cancer Chemotherapy. Circulation: Cardiovascular Imaging. 6 (6), 1080-1091 (2013).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Thavendiranathan, P., et al. Use of Myocardial Strain Imaging by Echocardiography for the Early Detection of Cardiotoxicity in Patients During and After Cancer Chemotherapy. A Systematic Review. 63 (25), Part A 2751-2768 (2014).
- Collier, P., Phelan, D., Klein, A. A Test in Context: Myocardial Strain Measured by Speckle-Tracking Echocardiography. Journal of the American College of Cardiology. 69 (8), 1043-1056 (2017).
- Hanekom, L., Cho, G. Y., Leano, R., Jeffriess, L., Marwick, T. H. Comparison of two-dimensional speckle and tissue Doppler strain measurement during dobutamine stress echocardiography: an angiographic correlation. European Heart Journal. 28 (14), 1765-1772 (2007).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Chen, J., et al. Displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND) reveals segmental susceptibility to doxorubicin-induced injury and regeneration. JCI Insight. 4 (8), e125362 (2019).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Journal of Visualized Experiments. (138), e57763 (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Lenneman, C. G., Sawyer, D. B. Cardio-Oncology: An Update on Cardiotoxicity of Cancer-Related Treatment. Circulation Research. 118 (6), 1008-1020 (2016).
- Geyer, H., et al. Assessment of Myocardial Mechanics Using Speckle Tracking Echocardiography: Fundamentals and Clinical Applications. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (4), 351-369 (2010).
- Castro, P. L., Greenberg, N. L., Drinko, J., Garcia, M. J., Thomas, J. D. Potential pitfalls of strain rate imaging: angle dependency. Biomedical Sciences Instrumentation. 36, 197-202 (2000).
- Seo, Y., Ishizu, T., Aonuma, K. Current Status of 3Dimensional Speckle Tracking Echocardiography: A Review from Our Experiences. Journal of Cardiovascular Ultrasound. 22 (2), 49-57 (2014).
- Amzulescu, M. S., et al. Improvements of Myocardial Deformation Assessment by Three-Dimensional Speckle-Tracking versus Two-Dimensional Speckle-Tracking Revealed by Cardiac Magnetic Resonance Tagging. Journal of the American Society of Echocardiography. 31 (9), 1021-1033 (2018).
- Wolterink, J. M., Leiner, T., Viergever, M. A., Išgum, I. Reconstruction, Segmentation, and Analysis of Medical Images. Zuluaga, M. A., et al. , Springer International Publishing. 95-102 (2016).
- Avendi, M. R., Kheradvar, A., Jafarkhani, H. A combined deep-learning and deformable-model approach to fully automatic segmentation of the left ventricle in cardiac MRI. Medical Image Analysis. 30, 108-119 (2016).
- Packard, R. R. S., et al. Automated Segmentation of Light-Sheet Fluorescent Imaging to Characterize Experimental Doxorubicin-Induced Cardiac Injury and Repair. Scientific Reports. 7 (1), 8603 (2017).
- Jay Kuo, C. C., Chen, Y.
- Natarajan, N., et al. Complement Receptor C5aR1 Plays an Evolutionarily Conserved Role in Successful Cardiac Regeneration. Circulation. 137 (20), 2152-2165 (2018).
- Zhukov, L., Barr, A. H. IEEE Visualization VIS 2003. , 597-602 (2003).
- Nielles-Vallespin, S., et al. In vivo diffusion tensor MRI of the human heart: Reproducibility of breath-hold and navigator-based approaches. Magnetic Resonance in Medicine. 70 (2), 454-465 (2013).
