In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Résumé

Ce protocole décrit l'isolement des cellules épithéliales de différentes régions anatomiques de la membrane amniotique humaine pour déterminer leur hétérogénéité et leurs propriétés fonctionnelles pour l'application possible dans les modèles cliniques et physiopathologiques.

Résumé

Plusieurs protocoles ont été rapportés dans la littérature pour l'isolement et la culture des cellules épithéliales amniotiques humaines (HAEC). Cependant, ceux-ci supposent que l'épithélium amniotique est une couche homogène. L'amnion humain peut être divisé en trois régions anatomiques : réfléchie, placentaire et ombilicale. Chaque région a des rôles physiologiques différents, tels que dans des conditions pathologiques. Ici, nous décrivons un protocole pour disséquer le tissu humain d'amnion dans trois sections et le maintenir in vitro. Dans la culture, les cellules dérivées de l'amnion réfléchi ont montré une morphologie cuboïde, alors que les cellules des régions placentaires et ombilicales étaient squamous. Néanmoins, toutes les cellules obtenues ont un phénotype épithélial, démontré par l'immunodétection de l'E-cadherin. Ainsi, étant donné que les régions placentales et réfléchies in situ diffèrent dans les composants cellulaires et les fonctions moléculaires, il peut être nécessaire que les études in vitro tiennent compte de ces différences, car elles pourraient avoir des implications physiologiques pour l'utilisation de l'AOHC dans biomédecine et l'application prometteuse de ces cellules en médecine régénérative.

Introduction

Les cellules d'épithélium amniotique humaine (HAEC) proviennent des premiers stades du développement embryonnaire, à environ huit jours de postfertilisation. Ils proviennent d'une population de cellules épithéliales squameuses de l'épiblaste qui dérivent de la couche la plus interne de la membrane amniotique¹. Ainsi, HAEC sont considérés comme des restes de cellules pluripotentes de l'épiblaste qui ont le potentiel de se différencier en trois couches germinales de l'embryon². Au cours de la dernière décennie, divers groupes de recherche ont mis au point des méthodes pour isoler ces cellules de la membrane amniotique à la....

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le comité d'éthique de l'Instituto Nacional de Perinatologa à Mexico (numéro d'enregistrement 212250-21041). Toutes les procédures effectuées dans le cours de ces études étaient conformes aux normes éthiques de l'Instituto Nacional de Perinatologa, de la Déclaration d'Helsinki et des lignes directrices énoncées dans la Norme officielle mexicaine du ministère de la Santé.

1. Préparation

1. Préparer une solution de 1x PBS avec EDTA. Pour ce faire, ajouter 500 oL de 0,5 M de stock EDTA dans 500 ml de 1x PBS pour une concentration finale de 0,5 mM EDTA.
2. Préparer le milieu de culture pour HAEC. Pr....

Résultats

HAEC ont été isolés de chacune des trois régions anatomiques de la membrane amniotique et individuellement cultivés in vitro. Après 48 h de culture, les cellules avec un phénotype épithélial ont adhéré à la surface de la plaque, bien que le milieu ait également contenu des débris de cellules et des cellules flottantes, qui ont été enlevés une fois que le milieu a été changé (figure 3).

Pendant le traitement de la culture primaire (passage zéro, P0), certaines comp.......

Discussion

Nous avons mis en œuvre un nouveau protocole pour isoler HAEC des membranes à terme. Il diffère des rapports précédents en ce que chaque membrane a été divisée en ses trois régions anatomiques avant l'isolement pour analyser des cellules de chacun.

Une des étapes les plus critiques dans le protocole est le lavage de la membrane pour enlever tous les caillots sanguins, car ils peuvent interférer avec l'activité de la trypsine lors de la séparation des cellules épithéliales. Le défaut d'exécuter.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
culture forts
2-Mercaptoéthanol	Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023		55 mM
Exempt d’animaux Recombinant humain EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotique-antimycotique	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific/Gibco	12430054	Supplémenté en glucose élevé et HEPES
EDTA	Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G		0,5 M
Cellule souche embryonnaire FBS, qualifiée	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10439024
Acides aminés non essentiels	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11140050	100X
Paraformaldéhyde	n’importe quelle marque
de pyruvate de sodium	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11360070	100 mM
de trypsine/EDTA 0,05 %	Thermo Fisher Scientific/Gibco	25300054
Matériel jetable
100 & micro ; m Filtre à cellules	Corning/Falcon	352360
100 mm Plat de culture traité TC	Corning	430167
24 puits Transparent traité TC Plaques à puits multiples	Corning/Costar	3526
Plaques à puits multiples traitées TC à 6 puits clairs	Corning/Costar	3516
Tube à centrifuger stérile non pyrogène	de toute marque		avec cône fond
Pointes stériles non apyrogènes de 1 000 & micro ; l, 200 et micro ; l et 10 µ ;l.
Gazes de coton stériles
	de toute marque
Équipement
Armoire
Micropipettes
Pipette motorisée Remplisseuse/Distributrice
Béchers stériles de 500 mL
Planche
Scalpels, ciseaux, pinces, pinces stériles
Récipient
plateau
	MaCSmix
Anticorps et kits			Antibody ID
Anti-E-cadhérine	BD Biosciences 610181		RRID :AB_3975
Anti-KI67	Santa Cruz	23900	RRID :AB_627859)
Anti-NANOG	Peprotech	500-P236	RRID :AB_1268274
Anti-OCT4	Abcam	AB19857	RRID :AB_44517
Anti-SOX2	Millipore	AB5603	RRID :AB_2286686
Signalisation cellulaire	anti-SSEA-4	4755	RRID :AB_1264259
Signalisation cellulaire	anti-TRA-1-60	4746	RRID :AB_2119059
Chèvre Anti-souris Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID :AB_2534088
Chèvre Anti-Lapin Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID :AB_10563566
Tunel Kit de dosage	Abcam	66110

de solution saline tamponnée au phosphate Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X (chlorure de sodium 0,9 %)n’importe quelle marque Pipettes sérologiques stériles de 5, 10 et 25 mL de toute marque Gants chirurgicaux stériles de sécurité biologique Centrifugeuse de pipettesà découper en plastique stérile stérile en acier inoxydableRotateur de tube à stérile