Perfusione e inflazione del polmone del topo per l'istologia tumorale
Summary
Lo scopo di questo metodo è quello di presentare un metodo semplice ed efficiente per la perfusione, l’inflazione e la fissazione dei polmoni del topo per l’esame della patologia tumorale polmonare e la valutazione delle metastasi al polmone.
Abstract
La capacità di valutare l’istologia polmonare è fondamentale per i campi della ricerca sul cancro ai polmoni e della metastasi tumorale. È altrettanto importante eseguire necrosi in modo rapido ed efficiente dagli studi senza sacrificare la qualità dei tessuti acquistati. L’obiettivo di questo protocollo è quello di presentare un metodo per perfondere, gonfiare e fissare rapidamente i polmoni del topo per l’analisi istologica a valle. Questo metodo non standardizza l’inflazione polmonare; pertanto, non richiede procedure o attrezzature speciali e invece infonde semplicemente fissativo direttamente attraverso la trachea che segue la perfusione attraverso il cuore. Ciò consente una stima sufficiente delle dimensioni del tumore, dell’istologia e del punteggio. Ciò consente anche la raccolta di tessuto congelato prima della fissazione del tessuto polmonare. Questo metodo è limitato in quanto non consente una successiva quantificazione morfometrica del polmone; tuttavia, è più che sufficiente per l’analisi del tumore polmonare da modelli di topi geneticamente modificati (GEMM), modelli sigeneici, così come studi sul tumore allo xenografto e sulla metastasi.
Introduction
Esistono una varietà di modelli di topo di oncogenesi polmonare e metastasi tumorale al polmone che vanno dai complessi GEMM ai modelli indotti da cancerogeni ai modelli sigeneici e xenograftici, dove le cellule tumorali vengono iniettate tramite intracardiaco, intratoracico, vena di coda o altri metodi per stabilire tumori all’interno del polmone. Tutti questi modelli condividono la comune necessità di valutazione istologica dell’istologia e della patologia polmonare. Pertanto, è necessario avere un metodo robusto ma rapido per eseguire necropsie di topi mentre si perfondono i polmoni per rimuovere il sangue in eccesso e gonfiare e fissare i polmoni per visualizzare chiaramente l’architettura polmonare. La velocità è un componente critico di questa procedura in quanto potrebbe essere necessario raccogliere i polmoni da dozzine di topi in un singolo momento. Questa procedura può essere eseguita in meno di 6 minuti per mouse.
Sebbene questa procedura sia più che sufficiente per valutare l’istologia tumorale, non è raccomandata per coloro che desiderano eseguire misurazioni stereologiche o morfometriche dei polmoni. Tali misurazioni richiedono che l’inflazione polmonare sia standardizzata, così come il calcolo della superficie assoluta del polmone, del volume assoluto e delle dimensioni alveolari e delnumero 1. Questo metodo non è ottimale anche per alcuni approcci di imaging. Ad esempio, l’imaging dei polmoni tramite μCT per l’analisi morfometrica ex vivo richiede che i polmoni rimangano riempiti d’aria2. Quando la conservazione degli spazi e delle dimensioni dell’aria è la preoccupazione principale, si consiglia di fissare i polmoni con tecniche di disidratazioneperfusione 3,4. Una delle maggiori preoccupazioni di questo modello è il potenziale di rupturing delle pareti alveolari, che ne diminuisce l’uso negli studi sull’enfisema; tuttavia, la procedura raccomandata per la fissazione dei polmoni per lo studio dell’enfisema è ancora abbastanza simile, in quanto si raccomanda di fissare i polmoni per instillazione intratracheale del 10% di formalina (simile al protocollo qui descritto) sotto pressione costante del fluido o mediante fissazione in situ5.
Il vantaggio della procedura descritta qui è che non richiede una pressione costante del fluido, ma gonfia i polmoni fino a quando non si sono completamente espansi, diminuendo così il tempo necessario per la procedura. La procedura qui descritta assomiglia molto ai metodi raccomandati da un armamentario della Society of Toxicologic Pathology, dove è stato formato un sottocomitato per raccomandare i migliori metodi di fissazione polmonare per gli studi tossicologici. La maggior parte degli scienziati all’interno di questa sottocommissione ha raccomandato di fissare i polmoni mediante instillazione intratracheale con una siringa, anche se c’erano raccomandazioni variabili sul tempo in cui il polmone è stato lasciato nelfissatore 6. Pertanto, mentre esistono una varietà di metodi di inflazione polmonare e fissazione, il metodo descritto nel presente documento è proposto come metodo ottimale per gonfiare e fissare rapidamente i polmoni per la valutazione istologica del tumore a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura sopra descritta per la perfusione, l’inflazione e la fissazione dei polmoni del topo è ideale per una preparazione rapida ed efficiente dei polmoni del topo per l’istologia del tumore polmonare e l’analisi della patologia. La procedura non richiede alcuna attrezzatura speciale e può essere eseguita in meno di 6 minuti per mouse. La procedura non richiede un volume fisso per l’inflazione né una pressione fluida costante. Poiché questa procedura non è standardizzata, non è raccomandata per coloro che des…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Center for Advancing Translational Sciences con il premio UL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
