Combiner la microdissection de capture laser et le QPCR microfluidique pour analyser les profils transcriptionnels des cellules uniques : une approche de biologie des systèmes à la dépendance aux opioïdes
Summary
Ce protocole explique comment collecter des neurones uniques, des microglies et des astrocytes du noyau central de l’amygdale avec une grande précision et une spécificité anatomique à l’aide de la microdissection de capture laser. En outre, nous expliquons notre utilisation de microfluidique RT-qPCR pour mesurer un sous-ensemble du transcriptome de ces cellules.
Abstract
L’hétérogénéité transcriptionnelle profonde dans les cellules simples anatomiquement adjacentes suggère que la fonctionnalité robuste de tissu puisse être réalisée par la diversité cellulaire de phénotype. Les expériences à cellule unique qui étudient la dynamique du réseau des systèmes biologiques démontrent des réponses cellulaires et tissulaires à diverses conditions à une résolution biologiquement significative. Ici, nous expliquons nos méthodes pour recueillir des cellules uniques à partir d’endroits anatomiquement spécifiques et mesurer avec précision un sous-ensemble de leurs profils d’expression génique. Nous combinons la microdissection de capture laser (LCM) avec des réactions microfluidiques de la chaîne quantitative de polymérase de transcription inverse (RT-qPCR). Nous utilisons également cette plate-forme microfluidique RT-qPCR pour mesurer l’abondance microbienne du contenu intestinal.
Introduction
La mesure des profils d’expression génique des cellules simples a démontré une hétérogénéité phénotypique étendue dans un tissu. Cette complexité a compliqué notre compréhension des réseaux biologiques qui régissent la fonction tissulaire. Notre groupe et d’autres ont exploré ce phénomène dans de nombreux tissus et conditions1,2,3,4,5,6. Ces expériences suggèrent non seulement que la régulation des réseaux d’expression génique sous-tend une telle hétérogénéité, mais aussi que la résolution à cellule unique révèle une complexité dans la fonction tissulaire que la résolution au niveau tissulaire ne parvient pas à apprécier. En effet, une petite minorité de cellules peut répondre à une condition ou un défi spécifique, mais l’impact de ces cellules sur la physiologie globale peut être considérable. En outre, une approche de biologie du système qui applique des méthodes multivariées à des jeux de données de haute dimension provenant de plusieurs types de cellules et tissus peut élucider les effets de traitement à l’échelle du système.
Nous combinons LCM et microfluidique RT-qPCR pour obtenir de tels ensembles de données. Nous adoptons cette approche ici en contraste avec la collecte de cellules individuelles via le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et en utilisant le séquençage de l’ARN (ARN-seq) pour mesurer leur transcriptome. L’avantage de LCM par rapport à FACS est que la spécificité anatomique exacte des cellules simples peut être documentée avec LCM, relativement et absolument. En outre, alors que l’ARN-seq peut mesurer plus de fonctionnalités que RT-qPCR, microfluidique RT-qPCR est moins cher et a une sensibilité plus élevée et la spécificité7.
Dans cette expérience représentative, nous avons étudié les effets de la dépendance aux opioïdes et le sevrage opioïde naltrexone-précipité sur le rat neuronal, microglia, et l’expression de gène d’astrocyte dans le noyau central de l’amygdale (CeA) et l’abondance de microflora intestinale4. Quatre groupes de traitement ont été analysés : 1) Placebo, 2) Morphine, 3) Naltrexone, et 4) Retrait(figure 1). Nous avons constaté que la dépendance aux opioïdes n’altait pas considérablement l’expression des gènes, mais que le sevrage des opioïdes incitait l’expression de gènes inflammatoires, Tnf en particulier. Les astrocytes étaient le type de cellule le plus affecté. Le microbiome intestinal a été profondément affecté par le sevrage des opioïdes comme indiqué par une diminution du rapport Firmicutes à Bacteroides, qui est un marqueur établi de dysbiose intestinale8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
La biologie unicellulaire a démontré l’hétérogénéité des phénotypes cellulaires et la robustesse de la fonction tissulaire. Ces résultats ont permis de mieux comprendre l’organisation des systèmes biologiques à la fois à des échelles macro et micro. Ici, nous décrivons la combinaison de deux méthodes, LCM et qPCR microfluidique, pour obtenir des mesures de transcriptome à cellule unique qui fournissent la spécificité anatomique et l’exactitude transcriptionnelle à un coût relativement faible<str…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux présentés ici ont été financés par NIH HLB U01 HL133360 attribué à JS et RV, NIDA R21 DA036372 décerné à JS et EVB, et T32 AA-007463 attribué à Jan Hoek à l’appui de SJO’S.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
