レーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体qPCRを組み合わせて単一細胞の転写プロファイルを解析する:オピオイド依存へのシステム生物学アプローチ
Summary
このプロトコルは、レーザーキャプチャマイクロ解剖を使用して、扁桃体の中心核から単一のニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトを高精度かつ解剖特異性で収集する方法を説明します。さらに、これらの細胞のトランスクリプトームのサブセットを測定するためのマイクロ流体RT-qPCRの使用について説明する。
Abstract
解剖学的に隣接する単一細胞における深い転写ヘテロジニティは、細胞表現型多様性によって堅牢な組織機能が達成される可能性があることを示唆している。生体系のネットワークダイナミクスを調べている単細胞実験は、生物学的に意味のある分解能で様々な条件に対する細胞および組織応答を実証する。ここでは、解剖学的に特定の場所から単一細胞を収集し、その遺伝子発現プロファイルのサブセットを正確に測定する方法を説明する。レーザー捕捉マイクロディスセクション(LCM)とマイクロ流体逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を組み合わせたものです。また、この微流量RT-qPCRプラットフォームを使用して、腸内含量の微生物の存在量を測定します。
Introduction
単一細胞の遺伝子発現プロファイルを測定すると、組織内で広範な表現型ヘテロジニティが実証されています。この複雑さは、組織機能を支配する生物学的ネットワークの理解を複雑にしています。私たちのグループと他の人々は、多くの組織や条件1、2、3、4、5、6でこの現象を探求してきました。これらの実験は、遺伝子発現ネットワークの調節がそのような不均一性の根源であることを示唆するだけでなく、単細胞分解能が組織レベルの分解能が理解できない組織機能の複雑さを明らかにすることを示唆している。実際、少数の細胞が特定の状態や課題に反応するかもしれませんが、それらの細胞が全体的な生理学に与える影響は大きいかもしれません。さらに、多変量法を複数の細胞タイプおよび組織からの高次元データセットに適用するシステム生物学アプローチは、システム全体の治療効果を解明することができる。
LCMとマイクロ流体RT-qPCRを組み合わせて、そのようなデータセットを取得します。ここでは、蛍光活性化細胞選別(FACS)を介して単一細胞を収集し、RNAシーケンシング(RNA-seq)を使用してトランスクリプトームを測定する方法とは対照的に、このアプローチを取ります。FACSに対するLCMの利点は、単一細胞の正確な解剖特異性をLCMで比較的絶対的に文書化できることです。また、RNA-seqはRT-qPCRというより多くの特徴を測定できるが、マイクロ流体RT-qPCRは安価であり、感度と特異性が高い7。
本代表的な実験では、扁桃体の中心核におけるラット神経、ミクログリア、およびアストロサイト遺伝子発現に対するオピオイド依存性およびナルトレキソン沈殿したオピオイド離脱の影響を調べた。4つの治療群を分析した:1)プラセボ、2)モルヒネ、3)ナルトレキソン、および4)離脱(図1)。我々は、オピオイド依存性が遺伝子発現を実質的に変化させなかったが、オピオイド離脱が炎症性遺伝子、特にTnfの発現を誘発することを発見した。アストロサイトは最も影響を受けた細胞型であった。腸内微生物叢は、腸内ジスビオシス8,9の確立されたマーカーであるバクテロイデス比に対するフィルミキュートの減少によって示されるように、オピオイド離脱によって深く影響を受けた。
Protocol
Representative Results
Discussion
単細胞生物学は、細胞の発現型の不均一性と組織機能の堅牢性を実証した。これらの知見は、マクロおよびマイクロスケールの両方で生物学的システムの組織に関する洞察を提供してきた。ここでは、LCMとマイクロ流体qPCRの2つの方法の組み合わせを説明し、比較的低コストで解剖特異性および転写精度を提供する単細胞転写法を得る(図1)。私たちのグループは、シス?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ここで発表された作品は、JSとRVに授与されたNIH HLB U01 HL133360、JSとEVBに授与されるNIDA R21 DA036372、およびSJOの支援としてヤン・フックに授与されたT32 AA-007463を通じて資金提供されました。
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
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