레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법
Summary
이 프로토콜은 레이저 포획 미세 분면을 사용하여 높은 정확도와 해부학 적 특성으로 편도체의 중앙 핵에서 단일 뉴런, 마이크로 글리아 및 성상 세포를 수집하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 이 세포의 전사체의 부분 집합을 측정하기 위하여 미세 유체 성 RT-qPCR의 우리의 사용을 설명합니다.
Abstract
해부학적으로 인접한 단일 세포에서 심오한 전사 이질성은 강력한 조직 기능이 세포 표현형 다양성에 의해 달성될 수 있음을 시사한다. 생물학적 시스템의 네트워크 역학을 조사하는 단세포 실험은 생물학적으로 의미 있는 해상도에서 다양한 조건에 대한 세포 및 조직 반응을 입증합니다. 본 명세서에서, 우리는 해부학적으로 특정 한 위치에서 단 하나 세포를 집합하고 정확하게 그들의 유전자 발현 단면도의 부분 집합을 측정하기 위한 우리의 방법을 설명합니다. 우리는 레이저 포획 미세 해부 (LCM)와 미세 유체 역 전사 정량 중합효소 연쇄 반응 (RT-qPCR)을 결합합니다. 우리는 또한 이 미세 유체 RT-qPCR 플랫폼을 사용하여 장 내용물의 미생물 풍부를 측정합니다.
Introduction
단일 세포의 유전자 발현 프로파일을 측정하는 것은 조직 내에서 광범위한 표현형 이질성을 입증하였다. 이 복잡성은 조직 기능을 통제하는 생물학 네트워크의 우리의 이해를 복잡하게 했습니다. 우리 그룹과 다른 사람들은 많은 조직과 조건에서이 현상을탐구했다1, 2,3,4,5,6. 이러한 실험은 유전자 발현 네트워크의 조절이 이러한 이질성의 근간을 이룬다는 것을 시사할 뿐만 아니라, 단일 세포 분해능이 조직 수준의 분해능이 인식되지 못하는 조직 기능의 복잡성을 드러낸다. 실제로, 세포의 단지 작은 소수민족은 특정 조건 또는 도전에 반응할 수 있습니다, 그러나 전반적인 생리학에 그 세포의 충격은 실질적일지도 모릅니다. 또한 다중 세포 유형 및 조직에서 고차원 데이터 세트에 다변량 방법을 적용하는 시스템 생물학 접근법은 시스템 전반의 치료 효과를 해명할 수 있습니다.
우리는 이러한 데이터 세트를 얻기 위해 LCM 및 미세 유체 RT-qPCR을 결합합니다. 우리는 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 통해 단 하나 세포를 집합하고 RNA 염기서열 분석 (RNA-seq)를 사용하여 그들의 전사체를 측정하는 것과는 대조적으로 여기에서 이 접근을 취합니다. FACS에 비해 LCM의 장점은 단일 세포의 정확한 해부학적 특이성을 LCM으로 비교적 그리고 절대적으로 문서화할 수 있다는 것입니다. 또한, RNA-seq는 RT-qPCR, 미세유체 RT-qPCR이 저렴하고 더 높은 감도 및 특이성을 가지는 더 많은 특징을 측정할 수 있는 반면7.
이러한 대표적인 실험에서, 우리는 편도체(CeA) 및 장내 미생물 풍부의 중앙 핵에서 쥐 신경, 마이크로글리아 및 성상세포 유전자 발현에 대한 오피오이드 의존성 및 날트렉손 침전된 오피오이드 의 효과를조사하였다 4. 4개의 처리 단을 분석하였다: 1) 위약, 2) 모르핀, 3) 날트렉손, 및 4) 철수(도 1). 우리는 오피오이드 의존성이 유전자 발현을 실질적으로 변경하지 않았다는 것을 발견했지만, 오피오이드 금단은 특히 선동적인 유전자, Tnf의 발현을 유도하였다. 성상 세포는 가장 영향을 받는 세포 유형이었다. 장내 미생물군유전체는 오피오이드 인출에 의해 심오하게 영향을 받았는데, 이는 장이뇨증8,9의확립된 마커인 박테로이드 비율에 대한 Firmicutes의 감소에 의해 나타났다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단세포 생물학은 세포 표현형의 이질성과 조직 기능의 견고성을 입증했습니다. 이 사실 인정은 거시와 마이크로 규모 둘 다에 생물학 시스템의 조직에 통찰력을 제공했습니다. 여기서, 우리는 비교적 저렴한 비용으로 해부학적 특이성 및 전사 정확도를 제공하는 단일 세포 전사체 측정을 얻기 위해 LCM 및 미세 유체 qPCR이라는 두 가지 방법의 조합을설명한다(도 1). 우리 그룹…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
여기에 제시된 작품은 JS와 RV에 수여 NIH HLB U01 HL133360을 통해 투자되었다, JS와 EVB에 수여 NIDA R21 DA036372, T32 AA-007463 SJO의 지원을 위해 얀 후크에 수여.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
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