मिमूत्र आइलेट्स के इंगुइनल सबक्यूटिनियस व्हाइट एडीपोज टिश्यू (आईएसवाट) प्रत्यारोपण मॉडल
Summary
इस प्रोटोकॉल में, मूत्र आइलेट अलगाव और प्रत्यारोपण की एक विधि इंगिनल चमड़े के नीचे वसा ऊतक में वर्णित है। अलग सिंजेनिक मूत्र आइलेट्स एक तहखाने झिल्ली हाइड्रोजेल का उपयोग कर एक मूत्र प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित कर रहे हैं । प्राप्तकर्ताओं के रक्त ग्लूकोज स्तर की निगरानी की जाती है, और आइलेट ग्राफ्ट का हिस्टोलॉजी विश्लेषण किया जाता है।
Abstract
अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण प्रकार 1 मधुमेह के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित चिकित्सकीय उपचार है। किडनी कैप्सूल कृंतक मॉडल में आइलेट प्रत्यारोपण के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली साइट है। हालांकि, तंग गुर्दे कैप्सूल बड़े जानवरों और मनुष्यों में पर्याप्त आइलेट्स के प्रत्यारोपण को सीमित करता है। इंगिनल चमड़े के नीचे वसा ऊतक (ISWAT), एक नया चमड़े के नीचे अंतरिक्ष, आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक संभावित मूल्यवान साइट पाया गया था । इस साइट में अन्य चमड़े के नीचे रिक्त स्थान की तुलना में बेहतर रक्त आपूर्ति है। इसके अलावा, ISWAT गुर्दे कैप्सूल की तुलना में एक बड़ा आइलेट द्रव्यमान को समायोजित करता है, और इसमें प्रत्यारोपण सरल है। यह पांडुलिपि सिंजेनिक मधुमेह माउस प्राप्तकर्ताओं के ISवाट साइट में माउस आइलेट अलगाव और प्रत्यारोपण की प्रक्रिया का वर्णन करती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, murine अग्नाशय आइलेट्स मानक कोलेजेनेज पाचन द्वारा अलग थे और इस्वाट साइट में शुद्ध आइलेट्स को ठीक करने के लिए एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स हाइड्रोगेल का उपयोग किया गया था। प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त शर्करा के स्तर पर १०० से अधिक दिनों तक नजर रखी गई । आइलेट ग्राफ्ट हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए प्रत्यारोपण के बाद १०० दिन में प्राप्त किए गए थे । इस पांडुलिपि में वर्णित आइवाट साइट में आइलेट प्रत्यारोपण के लिए प्रोटोकॉल सरल और प्रभावी है।
Introduction
इंटरनेशनल डायबिटीज फेडरेशन (आईडीएफ)1के सांख्यिकीय आंकड़ों के अनुसार, दुनिया भर में घटना और प्रकार की व्यापकता 1 मधुमेह मेलिटस (T1DM) जल्दी से बढ़ रहे हैं । आइलेट प्रत्यारोपण T1DM4के इलाज के लिए सबसे आशाजनक दृष्टिकोणों में से एक है । एडमोंटन प्रोटोकॉल2 का उपयोग करनैदानिक आइलेट प्रत्यारोपण में की गई महान सफलता की सूचना दी गई थी, 5 साल बाद T1DM प्राप्तकर्ताओं में कार्य करने वाले आइलेट भ्रष्टाचार अस्तित्व अब लगभग 50%3तक पहुंच गया है।
अतीत में, कई प्रत्यारोपण साइटों, जैसे जिगर, गुर्दे कैप्सूल, तिल्ली, इंट्रामस्कुलर क्षेत्र, चमड़े के नीचे अंतरिक्ष, अस्थि मज्जा, और ओमेंटल थैली प्रायोगिक आइलेट प्रत्यारोपण5,6,7के लिए पता लगाया गया । उपरोक्त साइटों में से कुछ का परीक्षण नैदानिक सेटिंग्स8में किया गया है । हालांकि जिगर में आइलेट प्रत्यारोपणवर्तमान9 में नैदानिक आवेदन में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि बनी हुई है, इस साइट का उपयोग करते समय संबोधित करने के लिए कई महत्वपूर्ण समस्याएं हैं। उदाहरण के लिए, तत्काल रक्त मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया (IBMIR) और खराब ऑक्सीजनकी आपूर्ति10,11 और यदि आवश्यक हो तो आइलेट ग्राफ्ट को पुनः प्राप्त करने के लिए प्रत्यारोपित आइलेट के शुरुआती नुकसान को कैसे कम किया जाए, क्योंकि वे जिगर में फैलाना। गुर्दे कैप्सूल कृंतक प्राप्तकर्ताओं के लिए एक आदर्श साइट हो सकती है। हालांकि, तंग गुर्दे कैप्सूल मनुष्यों में पर्याप्त एलोजेनिक आइलेट्स के प्रत्यारोपण को सीमित करता है, हालांकि यह चिकित्सकीय रूप सेउपयोगकी जाने वाली अत्यधिक शुद्ध पोर्सिन आइलेट तैयारी के कारण आइलेट ज़ेनोट्रांसप्लांटेशन के लिए बेहतर फिट हो सकताहै। इसलिए, आइलेट प्रत्यारोपण के लिए अधिक उपयुक्त साइट की खोज चल रही है।
चमड़े के नीचे अंतरिक्ष अपनी पहुंच के कारण आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक चिकित्सकीय लागू साइट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, सबसे नीचे अंतरिक्ष में आइलेट प्रत्यारोपण की दक्षता बेहद कम है, इस प्रकार हाइपरग्लाइसेमिया13को रिवर्स करने के लिए अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में आइलेट्स की आवश्यकता होती है। हाल ही में, एक जापानी अनुसंधान टीम ISWAT, एक उपन्यास चमड़े के नीचे एक मूत्र मॉडल में आइलेट प्रत्यारोपण के लिए बेहतर साइट पाया जब जिगर14की तुलना में । आईएसवाट में एपिगास्ट्रिक धमनी और नस शामिल है, इसलिए समृद्ध रक्त आपूर्ति आइलेट भ्रष्टाचार संशोधन सुनिश्चित कर सकती है। इस पांडुलिपि में, हम इस्वाट में सिंजेनिक मैरिन आइलेट्स को ठीक करने के लिए बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स हाइड्रोगेल का उपयोग करके एक आसान प्रत्यारोपण विधि का प्रस्ताव करते हैं। यह प्रोटोकॉल आइलेट प्रत्यारोपण के लिए प्रभावी साबित होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अग्न्याशय आइलेट प्रत्यारोपण T1DM के इलाज के लिए एक आशाजनक चिकित्सा है । इस चिकित्सा का प्रभाव कई कारकों से प्रभावित होता है और आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक इष्टतम साइट चुनना अत्यंत महत्वपूर्ण है। आइलेट प…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2017YFC1103704) गुआंगदोंग प्रांत (2019) में उच्च स्तरीय अस्पतालों के निर्माण के लिए विशेष धन, शेनझेन में चिकित्सा की संमिंग परियोजना (SZSM201412020), उच्च स्तर के लिए निधि से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था शेर्ज़ेन का चिकित्सा अनुशासन निर्माण (2016031638), शेनझेन फाउंडेशन ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (JCJY2016029204849975, GJHZ20170314171357556), शेनझेन फाउंडेशन ऑफ हेल्थ एंड फैमिली प्लानिंग कमीशन (एसजेडएक्सजे2017021SZXJ20180955 चीन के गुआंगदोंग प्रांत के वैज्ञानिक अनुसंधान फाउंडेशन (A2019218), चीन पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन (2018M633218) ।
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
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