Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)
Summary
In questo protocollo, viene descritto un metodo di isolamento murine ilet e trapianto nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale. Le isole di murine singeniche isolate vengono trapiantate in un recipiente murino utilizzando un idrogel di membrana sotterranea. Viene monitorato il livello di glucosio nel sangue dei destinatari e viene eseguita l’analisi istologia degli innesti di islet.
Abstract
Il trapianto di islet pancreatico è un trattamento terapeutico consolidato per il diabete di tipo 1. La capsula renale è il sito più comunemente usato per il trapianto di isolotto nei modelli di roditori. Tuttavia, la capsula renale stretta limita il trapianto di isole sufficienti negli animali di grandi dimensioni e negli esseri umani. Il tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale (ISWAT), un nuovo spazio sottocutaneo, è stato trovato come un sito potenzialmente prezioso per il trapianto di isolotto. Questo sito ha un migliore apporto di sangue rispetto ad altri spazi sottocutanei. Inoltre, l’ISWAT ospita una massa di isolotto più grande della capsula renale, e il trapianto in esso è semplice. Questo manoscritto descrive la procedura di isolamento e trapianto di isolotti di topo nel sito ISWAT dei destinatari di topi diabetici singenici. Utilizzando questo protocollo, le isole pancreatiche murine sono state isolate dalla digestione standard del collagenase e un idrogel a matrice di membrana seminterrato è stato utilizzato per fissare le isole purificate nel sito ISWAT. I livelli di glucosio nel sangue dei topi riceventi sono stati monitorati per più di 100 giorni. Gli innesti di isle sono stati recuperati al giorno 100 dopo il trapianto per l’analisi istologica. Il protocollo per il trapianto di isolotto nel sito ISWAT descritto in questo manoscritto è semplice ed efficace.
Introduction
L’incidenza e la prevalenza a livello mondiale del diabete mellito di tipo 1 (T1DM) sono in rapido aumento, secondo i dati statistici della Federazione Internazionale del Diabete (IDF)1. Il trapianto di islet è uno degli approcci più promettenti per il trattamento del T1DM4. Dal momento che è stata riportata la grande scoperta nel trapianto di isolotto clinico utilizzando il protocollo di Edmonton2, la sopravvivenza dell’innesto di isolotto funzionante nei destinatari T1DM dopo 5 anni raggiunge circa il 50%3.
In passato, sono stati esplorati diversi siti di trapianto, come il fegato, la capsula renale, la milza, la regione intramuscolare, lo spazio sottocutaneo, il midollo osseo e il sacchetto omentale per il trapianto sperimentale di isolotto5,6,7. Alcuni dei siti di cui sopra sono stati testati in ambienti clinici8. Anche se il trapianto di isolotto nel fegato rimane il metodo più utilizzato nell’applicazione clinica attualmente9, ci sono diversi problemi importanti da affrontare quando si utilizza questo sito. Per esempio, come ridurre la perdita precoce delle isole trapiantate causata dalla reazione infiammatoria mediata istantanea del sangue (IBMIR) e scarsa ossigenazione fornire10,11 e come recuperare gli innesti di isole se necessario, perché si differenziano diffusamente nel fegato. La capsula renale può essere un sito ideale per i destinatari dei roditori. Tuttavia, la capsula renale stretta limita il trapianto di sufficienti isolotti allogenici negli esseri umani, anche se può essere una soluzione migliore per lo xenotrapianto delle isole a causa dei preparati altamente purificati dell’isolotto di porcina utilizzati clinicamente5,12. Pertanto, è in corso la ricerca di un sito più adatto per il trapianto di isolotto.
Lo spazio sottocutaneo può essere utilizzato come sito clinicamente applicabile per il trapianto di isolotto a causa della sua accessibilità. Tuttavia, l’efficienza del trapianto di isolotto nello spazio sottocutaneo è estremamente bassa, richiedendo quindi un numero relativamente elevato di isoloseri per invertire l’iperglicemia13. Recentemente, un team di ricerca giapponese ha trovato l’ISWAT, un nuovo sito sottocutaneo superiore per il trapianto di isolotto in un modello murino rispetto al fegato14. L’ISWAT contiene l’arteria epigastrica e la vena, quindi il ricco apporto di sangue può garantire la rivascolarizzazione dell’innesto delle isolotti. In questo manoscritto, proponiamo un metodo di impianto facile utilizzando un idrogel a matrice di membrana seminterrato per fissare isolotti di murini singenici nell’ISWAT. Questo protocollo si dimostra efficace per il trapianto di islet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il trapianto di issolota del pancreas è una terapia promettente per il trattamento del T1DM. L’effetto di questa terapia è influenzato da molti fattori e la scelta di un sito ottimale per l’impianto delle isolotto è estremamente importante. Il sito anatomico ideale per il trapianto di isolotto dovrebbe avere le seguenti caratteristiche: accessibilità per semplici procedure di trapianto, biopsia e recupero dell’innesto; complicanze ridotte; alto tasso di successo del controllo della glicemia; e la sopravvivenza a lung…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2017YFC1103704)Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia di Guangdong (2019), Sanming Project of Medicine a Shenzhen (S201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20229204849975, GJ-20170314171357555), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (S Scientific Research Foundation della Provincia cinese del Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
References
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