Inguinal Subkutan hvidt fedtvæv (ISWAT) Transplantation Model af Murine Holme
Summary
I denne protokol beskrives en metode til murineøsisolation og transplantation i det subkutane hvide fedtvæv. Isolerede murineholme transplanteres til en murinemodtager ved hjælp af en kældermembranhydrogel. Modtagernes blodsukkerniveau overvåges, og histologianalysen af islingtransplantaterne udføres.
Abstract
Pancreas islet transplantation er en veletableret terapeutisk behandling for type 1 diabetes. Nyrekapslen er det mest almindeligt anvendte sted for islettransplantation i gnavermodeller. Men, den stramme nyre kapsel begrænser transplantation af tilstrækkelige holme i store dyr og mennesker. Det ekutane subkutane hvide fedtvæv (ISWAT), et nyt subkutant rum, blev anset for at være et potentielt værdifuldt sted for ø-transplantation. Dette websted har bedre blodforsyning end andre subkutane rum. Desuden, ISWAT rummer en større dråbemasse end nyrekapsel, og transplantation i det er enkel. Dette manuskript beskriver proceduren for museøse isolation og transplantation i ISWAT site af syngeneic diabetisk mus modtagere. Ved hjælp af denne protokol, murine pancreas øer blev isoleret af standard kollagen fordøjelse og en kælder membran matrix hydrogel blev brugt til fastsættelse af rensede holme i ISWAT site. Blodsukkerniveauet for recipientmusene blev overvåget i mere end 100 dage. Isletgrafts blev hentet på dag 100 efter transplantation for histologisk analyse. Protokollen for lettransplantation i ISWAT-webstedet, der er beskrevet i dette manuskript, er enkel og effektiv.
Introduction
Den verdensomspændende forekomst og forekomst af type 1 diabetes mellitus (T1DM) er hurtigt stigende, ifølge de statistiske data fra International Diabetes Federation (IDF)1. Islettransplantation er en af de mest lovende tilgange til behandling af T1DM4. Da det store gennembrud i klinisk elet transplantation ved hjælp af Edmonton protokol2 blev rapporteret, fungerende islet graft overlevelse i T1DM modtagere efter 5 år nu når omkring 50%3.
I fortiden, flere transplantationssteder, såsom leveren, nyre kapsel, milt, intramuskulær region, subkutan plads, knoglemarv, og omental pose blev undersøgt for eksperimentel øtransplantationtransplantation 5,6,7. Nogle af de ovennævnte steder er blevet testet i kliniske indstillinger8. Selv om ø-transplantation i leveren er fortsat den mest udbredte metode i klinisk anvendelse på nuværendetidspunkt 9,der er flere vigtige problemer at løse, når du bruger dette websted. For eksempel, hvordan man kan reducere tidligt tab af de transplanterede holme forårsaget af instant blod medieret inflammatorisk reaktion (IBMIR) og dårlig iltning levering10,11 og hvordan man kan hente holmen grafts hvis det er nødvendigt, fordi de diffust lokalisere i leveren. Renal-kapslen kan være et ideelt sted for gnavere modtagere. Den stramme nyrekapsel begrænser imidlertid transplantationen af tilstrækkelige allogene holme hos mennesker, selv om den kan være bedre egnet til øxenotransplantation på grund af de meget rensede porcineøpræparater, der anvendes klinisk5,12. Derfor er søgningen efter et mere egnet sted for lettransplantation i gang.
Det subkutane rum kan anvendes som et klinisk anvendeligt sted for ø-transplantation på grund af dets tilgængelighed. Men effektiviteten af ø-transplantation i det subkutane rum er ekstremt lav, hvilket kræver et relativt stort antal holme til at vende hyperglykæmi13. For nylig fandt en japansk forskerhold ISWAT, en roman subkutan site overlegen for ø-transplantation i en murine model i forhold til leveren14. ISWAT indeholder epigastrisk arterie og vene, så den rige blodforsyning kan sikre ø-graft revaskularisering. I dette manuskript foreslår vi en nem implantationsmetode ved hjælp af en kældermembranmatrix hydrogel til at reparere de nyeste murineholme i ISWAT. Denne protokol viser sig effektiv til transplantation af fjord.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bugspytkirtel-olet transplantation er en lovende behandling til behandling af T1DM. Effekten af denne behandling påvirkes af mange faktorer og vælge et optimalt sted for islet implantation er yderst vigtigt. Det ideelle anatomiske sted for transplantation af fjorde bør have følgende karakteristika: tilgængelighed for simpel transplantation, biopsi og procedurer for transplantation af transplantater; reducerede komplikationer; høj succesrate for blodsukkerkontrol; og langvarig overlevelse af islettransplantaterne<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key R&D Program of China (2017YFC1103704)Særlige midler til opførelse af hospitaler på højt niveau i Guangdong-provinsen (2019), Sanming Project of Medicine i Shenzhen (SZSM201412020), Fonden for Højt Niveau Medicinsk disciplin Konstruktion af Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY201602204849975, GJHZ201703141713575556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Videnskabelig Forskning Foundation of Guangdong-provinsen i Kina (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).
- Pathak, V., Pathak, N. M., O’Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives. Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).
- Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. The Future of Islet Transplantation Is Now. Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).
- Stokes, R. A., et al. Transplantation sites for human and murine islets. Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).
- van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. The choice of anatomical site for islet transplantation. Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).
- Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation. Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).
- Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. Clinical islet transplantation: is the future finally now. Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).
- Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article. International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).
- Luan, N. M., Iwata, H. Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment. American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).
- Yasunami, Y., et al. A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver. Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).
- Rajab, A. Islet transplantation: alternative sites. Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).
- Ekser, B., Vagefi, P. A. Search for the best site in islet xenotransplantation. International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).
- Lu, Y., et al. A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse. Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
