Inguinal Subkutan vit fettvävnad (ISWAT) Transplantation modell av murinholmskulter
Summary
I detta protokoll beskrivs en metod för murinisletisolering och transplantation i inguinal subkutan vit fettvävnad. Isolerade syngeneic murine holmar transplanteras till en murine mottagare med hjälp av en källare membran hydrogel. Mottagarnas blodsockernivå övervakas och histologianalys av holmetransplantaten utförs.
Abstract
Pankreasholmstransplantation är en väletablerad terapeutisk behandling för typ 1-diabetes. Njurkapseln är den vanligaste platsen för holmtransplantation hos gnagare modeller. Den snäva njurkapseln begränsar dock transplantationen av tillräckliga öar hos stora djur och människor. Den inguinal subkutana vita fettvävnad (ISWAT), en ny subkutan utrymme, befanns vara en potentiellt värdefull plats för holme transplantation. Denna webbplats har bättre blodtillförsel än andra subkutanutrymmen. Dessutom rymmer ISWAT en större holme massa än njurkapseln, och transplantation i det är enkelt. Detta manuskript beskriver förfarandet för musislet isolering och transplantation i ISWAT platsen för syngeneic diabetiker mus mottagare. Med hjälp av detta protokoll isolerades murine bukspottkörteln holmar av standard kollagen matsmältningen och en källare membran matris hydrogel användes för fastställande av renade holmar i ISWAT webbplats. Mottagarmössens blodsockernivåer övervakades i mer än 100 dagar. Holme ympkvistar hämtades dag 100 efter transplantation för histologisk analys. Protokollet för holmtransplantation på ISWAT-webbplatsen som beskrivs i detta manuskript är enkelt och effektivt.
Introduction
Den globala förekomsten och förekomsten av typ 1 diabetes mellitus (T1DM) ökar snabbt, enligt statistiska uppgifter från International Diabetes Federation (IDF)1. Holme transplantation är en av de mest lovande metoder för behandling av T1DM4. Eftersom det stora genombrott som gjorts i klinisk holme transplantation med Edmonton protokoll2 rapporterades, fungerande holme moderplantor överlevnad i T1DM mottagare efter 5 år når nu ca 50%3.
Tidigare undersöktes flera transplantationsplatser, såsom lever, njurkapsel, mjälte, intramuskulära regionen, subkutant utrymme, benmärg och omental påse för experimentell holmetransplantation5,6,7. Några av ovanstående platser har testats i kliniska inställningar8. Även om holme transplantation i levern är fortfarande den mest använda metoden i klinisk tillämpning för närvarande9,Det finns flera viktiga problem att ta itu med när du använder denna webbplats. Till exempel, hur man kan minska tidig förlust av de transplanterade holmarna som orsakas av omedelbar blod medierad inflammatorisk reaktion (IBMIR) och dålig syresättning leverans10,11 och hur man hämtar holme ympkvistar om det behövs, eftersom de diffust lokalisera i levern. Njurkapseln kan vara en idealisk plats för gnagare mottagare. Den snäva njurkapseln begränsar dock transplantationen av tillräckliga allogena holmar hos människor, även om det kan vara en bättre passform för holme xenotransplantation på grund av de starkt renade svinholmspreparatsom används kliniskt5,12. Därför pågår sökandet efter en lämpligare plats för holmtransplantation.
Det subkutana utrymmet kan användas som ett kliniskt tillämpligt område för holmtransplantation på grund av dess tillgänglighet. Emellertid, effektiviteten av holme transplantation i subkutan utrymme är extremt låg, vilket kräver ett relativt stort antal öar för att vända hyperglykemi13. Nyligen fann en japansk forskargrupp ISWAT, en ny subkutan plats överlägsen för holme transplantation i en murine modell jämfört med levern14. ISWAT innehåller epigastrigasartär och ven, så den rika blodtillförseln kan säkerställa holme graft revascularization. I detta manuskript föreslår vi en enkel implantationsmetod med hjälp av en membranmatrishydrogel för att fixa syngeneic murine holmar i ISWAT. Detta protokoll visar sig vara effektivt för holme transplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pankreas holme transplantation är en lovande terapi för att behandla T1DM. Effekten av denna behandling påverkas av många faktorer och att välja en optimal plats för holme implantation är oerhört viktigt. Den idealiska anatomiska platsen för holmtransplantation bör ha följande egenskaper: tillgänglighet för enkla transplantations-, biopsi- och grafthämtningsförfaranden; minskade komplikationer; hög framgång av blodsockerkontroll; och långsiktig överlevnad av holme ympkvistar15<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från National Key FoU Program of China (2017YFC1103704)SpecialFunds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medicinsk disciplin Konstruktion av Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY2016029204849975, GJHZ201703141713575556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Scientific Research Foundation of Guangdong-provinsen i Kina (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).
- Pathak, V., Pathak, N. M., O’Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives. Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).
- Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. The Future of Islet Transplantation Is Now. Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).
- Stokes, R. A., et al. Transplantation sites for human and murine islets. Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).
- van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. The choice of anatomical site for islet transplantation. Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).
- Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation. Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).
- Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. Clinical islet transplantation: is the future finally now. Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).
- Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article. International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).
- Luan, N. M., Iwata, H. Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment. American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).
- Yasunami, Y., et al. A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver. Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).
- Rajab, A. Islet transplantation: alternative sites. Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).
- Ekser, B., Vagefi, P. A. Search for the best site in islet xenotransplantation. International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).
- Lu, Y., et al. A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse. Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
