通过2'，7'-二氯二氢氟辛二乙酸染色检测粘附细胞中的总活性氧物种
Summary
在这里，我们提出了一个协议，使用2’，7′-二氯二氢氟辛二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞活性氧物种（ROS）。2’，7′-二氯二氢氟酸酯（DCFH-DA）。该方法使用荧光显微镜可视化粘附细胞中的细胞ROS定位，并用荧光板读取器量化ROS强度。该协议简单、高效且经济高效。
Abstract
氧化应激是生理和病理条件下的一个重要事件。在这项研究中，我们演示了如何通过使用2’，7′-二氯二氢氟酸二乙酸（DCFH-DA）染色结在结肠直肠癌细胞系中测量总活性氧种类（ROS）来量化氧化应激。该协议描述了详细的步骤，包括制备DCFH-DA溶液、使用DCFH-DA溶液孵育细胞以及测量标准化强度。DCFH-DA 染色是检测细胞中 ROS 的一种简单且经济高效的方法。它可用于测量化学处理或基因修饰后产生的ROS。因此，它对于确定细胞氧化应力对环境压力的确定非常有用，为机械学研究提供了线索。
Introduction
细胞代谢产生的三种具有生理意义的主要活性氧种（ROS）是超氧化物类动物、羟基和过氧化氢1。在低浓度时，它们参与生理细胞过程，但在高浓度时，它们对细胞信号通路1有不利影响。我们的身体已经开发了抗氧化系统，这是有效的对抗过量的ROS。然而，当ROS压倒我们身体的排毒能力时，可能会出现氧化应激，这会导致许多病理状况，包括炎症、癌症和神经退行性疾病22，3，4。3,4该方法的目的是使用2’，7′-二氯二氢氟酸二乙酸（DCFH-DA）染色来确定粘附细胞中的总细胞ROS。其原理是DCFH-DA氧化为2′-7’二氯氟素（DCF）已被广泛用于总ROS检测，包括羟基基（+OH）和二氧化氮（#NO2）。从机械上讲，DCFH-DA被细胞所占用，细胞酯酶从乙酰组脱落，导致DCFH。ROS对DCFH的氧化将分子转化为DCF，DCF在485nm的激发波长和530nm的发射波长下发出绿色荧光。与用流细胞测定和其他替代方法5检测荧光相比，该方法采用荧光显微镜和板读取器的优点是产生清晰可见的荧光图像，易于执行、高效且经济高效。该方法已广泛用于检测细胞ROS，用于研究各种条件66，7，8。7,8该协议用于检测粘附细胞中的总 ROS。使用此方法检测悬浮细胞中的 ROS 可能需要一些修改。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处描述的实验协议易于重现，可测量细胞总 ROS。关键步骤包括使 DCFH-DA 解决方案新鲜，避免光线照射，最大限度地减少细胞状态干扰和大量 PBS 清洗，然后再拍摄图像。为准备DCFH-DA工作解决方案，在加入24井板之前，应将库存溶液添加到预热的DMEM中。原因是，产生高背景荧光或轻暴露的旧解决方案将导致光漂白。大多数研究使用1xPBS或1x汉克斯的平衡盐溶液（HBSS）稀释DCFH-DA，并将其用作反应缓…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国家卫生研究院（K01DK114390）的部分支持，美国癌症学会的研究学者资助（RSG-18-050-01-NEC），一项研究试点项目赠款 新墨西哥大学环境卫生签名计划和超级基金（P42 ES025589），共享资源试点项目奖和UNM综合癌症中心研究项目支持试点项目奖（P30CA118100），以及新墨西哥大学医学院专门健康研究基金颁发的新研究员奖。
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
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