Påvisning af totalreaktive iltarter i klæbende celler med 2',7'-Dichlordihydrofluorescein Diacetate Staining

Summary

Her præsenterer vi en protokol til påvisning af total cellulære reaktive iltarter (ROS) ved hjælp af 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA). Denne metode kan visualisere cellulær ROS lokalisering i klæbende celler med en fluorescens mikroskop og kvantificere ROS intensitet med en fluorescens plade læser. Denne protokol er enkel, effektiv og omkostningseffektiv.

Abstract

Oxidativt stress er en vigtig begivenhed under både fysiologiske og patologiske forhold. I denne undersøgelse demonstrerer vi, hvordan man kvantificerer oxidativt stress ved at måle den samlede reaktive iltart (ROS) ved hjælp af 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farvning i kolorektal cancer cellelinjer som et eksempel. Denne protokol beskriver detaljerede trin, herunder forberedelse af DCFH-DA-opløsning, inkubation af celler med DCFH-DA-opløsning og måling af normaliseret intensitet. DCFH-DA farvning er en enkel og omkostningseffektiv måde at opdage ROS i celler. Det kan bruges til at måle ROS generation efter kemisk behandling eller genetiske modifikationer. Derfor er det nyttigt til bestemmelse af cellulære oxidativstress på miljøstress, der giver spor til mekanistiske undersøgelser.

Introduction

Tre store reaktive ilt arter (ROS) produceret af cellulære stofskifte, der er af fysiologisk betydning er superoxid anion, hydroxyl radikal, og hydrogenperoxid¹. Ved lave koncentrationer deltager de i fysiologiske celleprocesser, men ved høje koncentrationer har de negative virkninger på cellesignalveje¹. Vores krop har udviklet antioxidantsystemer, som er effektive mod overdreven ROS. Men, oxidativ stress kan forekomme, når ROS overvælde afgiftende evne i vores krop, som bidrager til mange patologiske tilstande, herunder betændelse, kræft, og neurodegenerative sygdom^2,3,4. Formålet med denne metode er at bestemme total cellulær ROS i klæbende celler ved hjælp af 2′,7′-dichlordihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) farvning. Begrundelsen er, at oxidation af DCFH-DA til 2′-7’dichlorofluorescein (DCF) er blevet anvendt i udstrakt grad til total ROS-detektion, herunder hydroxylradikals (•OH) og nitrogendioxid (•NO₂). Mekanistisk, DCFH-DA er taget op af celler, hvor cellulære esterase kløver off acetyl grupper, hvilket resulterer i DCFH. Oxidation af DCFH ved ROS konverterer molekylet til DCF, som udsender grøn fluorescens ved en excitation bølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 530 nm. Sammenlignet med påvisning af fluorescens med flowcytometri og andre alternative metoder⁵er fordelene ved denne metode ved hjælp af et fluorescensmikroskop og en pladelæser, at den producerer klart synlige fluorescerende billeder og er let at udføre, effektiv og omkostningseffektiv. Denne metode er blevet anvendt i vid udstrækning til at opdage cellulære ROS for at studere forskellige betingelser^6,7,8. Denne protokol bruges til at registrere total ROS i klæbende celler. Brug af denne metode til at opdage ROS i suspension celler kan have brug for nogle ændringer.

Protocol

1. Cellesåning Seed 2 x 105 HCT116 kolorektal cancerceller pr godt i en 24-brønd plade og vedligeholde cellerne i Dulbecco modificerede Eagle medium (DMEM) natten ved 37 °C. Dyrkningsmediet udskiftes med eller uden 100 μM jernsulfat (FS) eller 10 μM doxorubicin (DOX), der indeholder medium og inkubat i 24 timer. 2. Forberedelse af DCFH-DA-løsningen 4,85 mg DCFH-DA opløses i 1 ml dimethylsulfoxid (DMSO) for at fremstille en 10 mM stamopløsn…

Representative Results

HCT116 kolorektal cancerceller blev behandlet med 100 μM FS eller 10 μM DOX for at fremkalde oxidativt stress7. Som vist i figur 1blev grøn fluorescens dramatisk forøget både FS og DOX som forventet. For at kvantificere den relative intensitetsændring blev cellerne lyset efter at have taget billeder og normaliseret med proteinkoncentrationer. Den kvantificerede fluorescensintensitet blev signifikant forøget af FS eller DOX i HCT116-celler. <p class="jove_co…

Discussion

Den eksperimentelle protokol, der er beskrevet her, er let reproducerbar at måle cellulære samlede ROS. De kritiske trin omfatter at gøre DCFH-DA-løsningen frisk og undgå lyseksponering, minimere forstyrrelser i cellestatus og omfattende PBS-vask lige før du tager billeder. Til fremstilling af DCFH-DA arbejdsløsning skal stamopløsningen tilsættes til forvarmet DMEM lige før tilsætning i 24 brøndpladen. Årsagen er, at gamle løsninger, der genererer høj baggrund fluorescens eller lyseksponering vil føre til…

Materials

2',7'-Dichlorofluorescein diacetate	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Doxorubicin hydrochloride	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	or any other fluorescence microplate reader