Kvantifiering av Metallurlakning i immobiliserad Metallaffinitetskromatografi

Summary

Vi presenterar en analys för enkel kvantifiering av metaller som introduceras i prover som bereds med immobiliserad metallaffinitetskromatografi. Metoden använder hydroxynaphthol blått som den kolorimetriska metall indikatorn och en UV-VIS spektrofotometer som detektorn.

Abstract

Förorening av enzymer med metaller som lakats från immobiliserade metallaffinitetskromatografi (IMAC) kolumner utgör ett stort bekymmer för enzymologer, eftersom många av de gemensamma di-och trivalenta katjoner som används i IMAC hartser har en hämmande effekt på enzymer. Omfattningen av utlakning av metaller och effekten av olika elminerande och reducerande reagenser är dock dåligt förstådd till stor del på grund av avsaknaden av enkla och praktiska kvantifieringsprotokoll för övergångsmetaller som använder utrustning som vanligtvis finns i biokemi Labs. För att lösa detta problem har vi utvecklat ett protokoll för att snabbt kvantifiera mängden metall förorening i prover som förberetts med IMAC som reningssteg. Metoden använder hydroxynaphtol blå (HNB) som en kolorimetrisk indikator för metall katjonhalten i en provlösning och UV-VIS-spektroskopi som ett sätt att kvantifiera mängden metall som finns, i nanomolar-området, baserat på förändringen i HNB-spektrumet vid 647 nm. Medan Metallhalt i en lösning historiskt har fastställts med hjälp av atomabsorptionsspektroskopi eller induktivt kopplade plasma tekniker, dessa metoder kräver specialiserad utrustning och utbildning utanför tillämpningsområdet för ett typiskt biokemi laboratorium. Den metod som föreslås här ger ett enkelt och snabbt sätt för biokemister att bestämma metallhalten i prover med hjälp av befintlig utrustning och kunskap utan att offra noggrannhet.

Introduction

Sedan starten av Porath och medarbetare¹, immobiliserade metallaffinitetskromatografi (iMac) har blivit en metod för val att snabbt separera proteiner baserat på deras förmåga att binda med övergång metalljoner såsom Zn²+, ni^{2 +}, Cu^{2 +}, och co^{2 +}. Detta görs oftast via konstruerade Poly-Histidine Taggar och är nu en av de vanligaste kromatografiska reningstekniker för isolering av rekombinanta proteiner². IMac har också funnit tillämpningar utöver rekombinant Proteinrening som ett sätt att isolera kinoloner, tetracykliner, aminoglykosider, makrolider, och β-lactams för mat provanalys³ och som ett steg i att identifiera blod-serumprotein markörer för lever och pankreascancer^4,5. Inte överraskande, iMac har också blivit en metod för val för isolering av ett antal infödda blockeringar enzymer^6,7,8,9,10. Men framgångsrikt genomförande av dessa reningsmetoder för studier av enzymatiskt aktiva bioenergetiska proteiner är beroende av närvaron av obetydliga nivåer av metallkatjoner som lakas från kolonnmatrisen till eluatet. De divalenta metallkatjoner som vanligen används i iMac har känd patologisk biologisk betydelse, även vid låga koncentrationer^11,12. Den fysiologiska effekten av dessa metaller är mest uttalad i bioenergetiska system, där de kan visa sig dödliga som hämmare av cellandning eller fotosyntes^13,14,15. Liknande frågor är oundvikliga för de flesta protein klasser där rester av främmande metaller kan störa proteiners biologiska funktioner eller karaktärisering med biokemiska och biofysiska metoder.

Även om halterna av metallkontaminering under oxiderande förhållanden och användning av Imidazol som eluant vanligtvis är låga¹⁶, proteinisoleringar utförs i närvaro av cystein reducerande medel (DTT, β-merkaptoetanol, etc.) eller med starkare kelatorer som histidin^17,18 eller etylendiamintetraättiksyra (EDTA) resultera i mycket högre nivåer av metall förorening^19,20. Likaså, eftersom metalljoner i IMAC hartser ofta samordnas av karboxylska grupper, protein elutioner utförs under sura förhållanden är också sannolikt att ha mycket högre nivåer av metall förorening. Metallhalten i lösningar kan bedömas med hjälp av atomabsorptionsspektroskopi (AAS) och induktivt kopplad plasma-masspektrometri (ICP-MS) ner till en detektionsgräns i ppb-PPT-intervallet^21,22,23,24. Tyvärr, AAS och ICP-MS är inte realistiska sätt för detektion i en traditionell biokemi Lab som dessa metoder skulle kräva tillgång till specialiserad utrustning och utbildning.

Tidigare arbete av Brittain^25,26 undersökt användningen av hydroxynaphthol blå (HNB) som ett sätt att identifiera förekomsten av övergångsmetaller i lösning. Det fanns dock flera interna motsägelser i data²⁰ och dessa arbeten misslyckades med att erbjuda ett adekvat protokoll. Studier av Temel et al.²⁷ och Ferreira et al.²⁸ expanderade på BRITTAIN arbete med HNB som en potentiell metall indikator. Dock utvecklade Temel ett protokoll som utnyttjar AAS för provanalys, med HNB endast som en kelat agent. Ferreiras studie använde förändringen i HNB absorbans Spectra på 563 nm, en region av fri-Dye HNB Spectra som överlappar kraftigt med spektra av HNB-metall komplex vid pH 5,7, vilket gör analysens känslighet ganska låg samt resulterar i relativt svag metallbindande samhörighet²⁰. För att lösa problem i vårt eget labb med ni^{2 +} urlakning från iMac har vi utökat det arbete som utförts av Brittain^25,26 och Ferreria²⁸ för att utveckla en enkel analys som kan detektera nanomolära nivåer av flera övergångsmetaller. Vi visade att HNB binder nickel och andra vanliga för IMAC metaller med sub-nanomolar bindande tillhörighet och form 1:1 komplex över ett brett spektrum av pH-värden²⁰. Analysen som rapporteras här baseras på dessa fynd och utnyttjar absorbansförändringar i HNB-spektrumet vid 647 Nm för metallkvantifiering. Analysen kan utföras i det fysiologiska pH-intervallet med hjälp av vanliga buffertar och instrumentering som finns i en typisk biokemi Lab med hjälp av kolorimetrisk detektion och kvantifiering av metall-färgkomplex och tillhörande förändring i absorbans av fri-färg när den binder till metall.

Protocol

1. förberedelse av komponent analys Bestäm vilka kromatografifraktioner som ska analyseras med optisk absorbans vid 280 nm eller alternativa metoder för proteinkvantifiering för att identifiera de proteinberikade fraktionerna.Obs: för detta arbete använde vi en diodarray UV-VIS spektrofotometer. För att öka genomströmningen kan en Plattläsare som klarar mätning av UV-VIS-absorbans användas. Beredning av nödvändiga analys komponenter Bered eller Erhåll 10-100 mM buffert (“pro…

Representative Results

Det spektrum av fria HNB vid neutral pH (svart linje) och representativa spektra av fraktioner analyseras för ni2 + från ISOLERINGEN av MSP1E3D129 visas i figur 2. En framgångsrik analysserie bör uppvisa en minskad absorbans vid 647 nm jämfört med HNB kontroll, vilket motsvarar bildandet av HNB komplex i närvaro av en övergång metall. En misslyckad analys skulle indikeras genom en ökning av absorbans vid 647 nm. Alternativt, mer än 90% minskning …

Discussion

Kolorimetrisk detektion av metaller med HNB ger ett enkelt sätt att kvantifiera graden av protein förorening genom övergång metalljoner från IMAC hartser. Som vi etablerat i Ref. 20 binder ni^{2 +} till hnb med 1:1 stoichiometri och dissociationskonstant för ni-HNB-komplexet ändras med pH. Dock är komplexet K_d i sub-nm-området för alla rekommenderade (7-12) pH-värden. I praktiken innebär det att alla ni^{2 +} i alla testade fraktioner kommer att binda till HNB så länge inga andra …

Materials

2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media for E.coli growth
HEPES, free acid	BioBasic	HB0264	alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, free acid	BioBasic	MB0360	alternative buffer
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium phosphate	Fisher Scientific	S369-500	alternative buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500