القياس الكمي للنض المعدني في الفصل اللوني لتقارب المعادن
Summary
نقدم فحصا للقياس الكمي السهل للمعادن التي تم إدخالها علي العينات المعدة باستخدام الكروماتوغرافي اللوني لتقارب المعادن. يستخدم الأسلوب هيدروكسينفثول الأزرق كما مؤشر المعادن اللونية والاشعه فوق البنفسجية-فيس الطيفية ككاشف.
Abstract
تلوث الانزيمات مع المعادن ترشح من المعادن غير المعباه اللوني تقارب (ايماك) الاعمده يشكل مصدر قلق كبير ل، كما العديد من الصفات الشائعة دي وثلاثي التكافؤ المستخدمة في راتنجات ايماك لها تاثير مثبط علي الانزيمات. ومع ذلك ، فان مدي الرشح المعدني وتاثير المواد الكاشفة المختلفة والحد منها غير مفهومين إلى حد كبير بسبب عدم وجود بروتوكولات بسيطه وعمليه للقياس الكمي للمعادن تستخدم المعدات المتاحة عاده في مختبرات الكيمياء الحيوية. ولمعالجه هذه المشكلة ، قمنا بوضع بروتوكول لتحديد كميه التلوث المعدني بسرعة في العينات المعدة باستخدام IMAC كخطوه تنقيه. يستخدم الأسلوب هيدروكسينفثول الأزرق (HNB) كمؤشر اللونية للمحتوي الموجبة المعادن في محلول عينه والاشعه فوق البنفسجية-فيس الطيفي كوسيلة لتحديد كميه المعادن الحالية, في نطاق نانومولار, استنادا إلى التغيير في الطيف HNB في 647 nm. في حين تم تحديد المحتوي المعدني في الحل تاريخيا باستخدام الطيفية الامتصاص الذري أو تقنيات البلازما مقترنة بشكل محفز ، وهذه الأساليب تتطلب معدات متخصصة والتدريب خارج نطاق مختبر الكيمياء الحيوية النموذجية. وتوفر الطريقة المقترحة هنا طريقه بسيطه وسريعة لعلماء الكيمياء الحيوية لتحديد المحتوي المعدني للعينات باستخدام المعدات والمعارف الموجودة دون التضحية بالدقة.
Introduction
منذ إنشائها من قبل Porath وزملاء العمل1، وقد تحولت اللونية تقارب المعادن (ايماك) وسيله للاختيار لفصل البروتينات بسرعة علي أساس قدرتها علي السندات مع الانتقال أيونات المعادن مثل الزنك2 +، Ni2 +، Cu2 +، وشارك2 +. هذا هو الأكثر شيوعا من خلال العلامات المهندسة بولي-histidine والآن واحده من تقنيات تنقيه الكروماتوغرافي الأكثر شيوعا لعزل البروتينات المؤتلف2. وقد وجد ايماك أيضا تطبيقات تتجاوز تنقيه البروتين المؤتلف كوسيلة لعزل الكينولونات ، التتراسيكلين ، امينونوغليكوسيدس ، الماكروليدات ، و β-اكتام لتحليل عينه الغذاء3 وكخطوه في تحديد علامات البروتين مصل الدم لسرطان الكبد والبنكرياس4،5. ليس من المستغرب, ايماك أصبح أيضا وسيله للاختيار لعزل عدد من الانزيمات طاقة الاصليه6,7,8,9,10. ومع ذلك ، فان التنفيذ الناجح لأساليب التنقية هذه للدراسات علي البروتينات الحيوية النشطة انزيمي يعتمد علي وجود مستويات تافه من الصفائح المعدنية التي يالم من مصفوفة العمود إلى الشطف وقد عرفت الكاتيونات المعادن ثنائي التكافؤ المستخدمة عاده في ايماك الاهميه البيولوجية باثولوجيك ، حتى في تركيزات منخفضه11،12. التاثير الفسيولوجي لهذه المعادن هو الأكثر وضوحا في النظم الحيوية ، حيث يمكن ان تكون مميته كمثبطات التنفس الخلوي أو التمثيل الضوئي13،14،15. وهناك مسائل مماثله لا مفر منها بالنسبة لغالبيه فئات البروتين حيث يمكن ان تتداخل معادن الملوثات المتبقية مع الوظائف البيولوجية للبروتين أو توصيفها بالتقنيات البيوكيميائية والبيوفيزيائية.
في حين ان مستويات التلوث المعدني في ظل الظروف المؤكسدة واستخدام ايميدازول كالتملص هي عاده منخفضه16، عزل البروتين التي أجريت في وجود عوامل الحد السيستين (dtt ، β-mercaptoethanol ، الخ) أو مع البخاخات اقوي مثل حامض17،18 أو حمض ايثيلليندياميتاتاتاستيك (أدتا) يؤدي إلى مستويات اعلي بكثير من تلوث المعادن19،20. المثل ، نظرا لان الأيونات المعدنية في راتنجات IMAC كثيرا ما تنسقها المجموعات الكربوكسيليه ، فان الشوائب البروتينية التي تتم في ظل الظروف الحمضية من المرجح ان يكون لها مستويات اعلي بكثير من التلوث المعدني. ويمكن تقييم المحتوي المعدني في الحلول باستخدام القياس الطيفي للامتصاص الذري (العاص) والبلازما المقترنة بالحث علي الطيف الكتلي (برنامج المقارنات الدولية) وصولا إلى حد الكشف في نطاق ppb-ppt21،22،23،24. ولسوء الحظ ، فان البرنامج والبرنامج ليسا وسيلتين واقعيتين للكشف في مختبر الكيمياء الحيوية التقليدية لان هذه الأساليب تتطلب الحصول علي المعدات المتخصصة والتدريب.
العمل السابق من قبل بريتن25,26 التحقيق في استخدام هيدروكسينفثول الأزرق (hnb) كوسيلة لتحديد وجود المعادن الانتقالية في الحل. ومع ذلك ، كانت هناك تناقضات داخلية عديده في البيانات20 ولم تقدم تلك الاعمال بروتوكولا ملائما. الدراسات التي قام بها Temel et al.27 و فيريرا وآخرون28 الموسعة علي العمل البرية مع hnb كمؤشر المعادن المحتملة. ومع ذلك ، وضعت Temel بروتوكول الذي يجعل من استخدام العاص لتحليل العينة ، وذلك باستخدام HNB فقط كعامل مخلبيه. وقد استخدمت دراسة فيريرا التغيير في أطياف الامتصاص HNB في 563 نانومتر ، وهي منطقه من أطياف الصبغة الحرة HNB التي تتداخل بشكل كبير مع أطياف المجمعات المعدنية HNB في الأس الهيدروجيني 5.7 ، مما يجعل حساسية الفحص منخفضه إلى حد ما ، فضلا عن الناتجة في ضعف نسبيا تقارب ربط المعادن20. لمعالجه القضايا في المختبر الخاص بنا مع Ni2 + الرشح من ايماك ، قمنا بتوسيع العمل الذي قام به البرية25،26 و ferreria28 لتطوير اختبار سهله قادره علي الكشف عن مستويات نانومولار العديد من المعادن الانتقالية. وأظهرنا ان HNB يربط النيكل وغيرها من المشتركة للمعادن ايماك مع التقارب النانومولار ملزمه وشكل مجمع 1:1 علي مجموعه واسعه من القيم pH20. ويستند الفحص المذكور هنا إلى هذه النتائج ويستخدم التغيرات الماصة في طيف HNB في 647 نانومتر للقياس الكمي للمعادن. ويمكن اجراء الفحص في نطاق الحموضة الفسيولوجية باستخدام المخازن المؤقتة المشتركة والاجهزه الموجودة في مختبر الكيمياء الحيوية النموذجية باستخدام الكشف عن ألوان والكمية من المعادن صبغ المجمعات والتغيير المرتبطة بها في الامتصاص من صبغ الحرة عندما يربط إلى المعدن.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكشف اللوني للمعادن باستخدام HNB يوفر طريقه بسيطه لقياس درجه تلوث البروتين من قبل الأيونات المعدنية الانتقالية من راتنجات ايماك. كما انشانا في المرجع 20 ، Ni2 + يربط إلى hnb مع 1:1 القياس والتفكك ثابت للتغيرات المعقدة NI-hnb مع درجه الحموضة. ومع ذلك ، فان المركب Kd في النطاق الفرعي لجميع ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتستند هذه المواد علي العمل الذي تدعمه المؤسسة الوطنية للعلوم تحت المنحة MCB-1817448 وجائزه من توماس ف. وكيت ميلر جيفريس التذكارية الاستئماني ، بنك أمريكا ، الوصي والمانحة المحددة هازل ثورب كارمان وجورج غاي كارمان الاستئماني.
Materials
| 2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
| HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
| HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
| Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
| Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
| MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
| Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |
References
- Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Block, H., et al. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
- Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs. Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).
- Felix, K., et al. Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia. Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).
- Wu, C., et al. Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).
- Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).
- Guergova-Kuras, M., et al. Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides. Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).
- Mitchell, D. M., Gennis, R. B. Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography. FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).
- Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).
- Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).
- Louie, A. Y., Meade, T. J. Metal complexes as enzyme inhibitors. Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).
- Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation. Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).
- Gerencser, L., Maroti, P. Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues. Biochimie. 40 (6), 1850-1860 (2001).
- Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).
- Link, T. A., von Jagow, G. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group. Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).
- Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy. Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
- Kokhan, O., Marzolf, D. R. Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue. Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).
- Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol. Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).
- Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. . Inorganic Chemical Biology. , (2014).
- Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS. Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).
- Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS. Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).
- Brittain, H. G. Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes. Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).
- Brittain, H. G. Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue. Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).
- Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry. Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).
- Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue. Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).
- Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).
- Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples. Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).
- Olmedo, P., et al. Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).
- Shyamal, M., et al. Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature. ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).
- Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration. Micromachines. 8 (4), 127 (2017).
- Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water. Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).
