Kwantificering van metaal uitspoeling in geïmmobiliseerde metaal Affiniteits chromatografie

Summary

We presenteren een assay voor eenvoudige kwantificering van metalen geïntroduceerd voor monsters bereid met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol blauw als de colorimetrische metalen indicator en een UV-VIS-spectrofotometer als de detector.

Abstract

Besmetting van enzymen met metalen uit geïmmobiliseerde metalen affiniteits chromatografie (IMAC) kolommen vormt een belangrijke zorg voor enzymologen, omdat veel van de gemeenschappelijke di-en trivalente kationen die worden gebruikt in IMAC-harsen een remmende werking op enzymen hebben. De omvang van het uitlogen van metaal en de impact van verschillende eluering-en reducerende reagentia zijn echter slecht begrepen voor een groot deel vanwege de afwezigheid van eenvoudige en praktische overgangs metaalkwantificerings protocollen die gebruikmaken van apparatuur die gewoonlijk beschikbaar is in Biochemie Labs. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld om snel de hoeveelheid metaalverontreiniging te kwantificeren in monsters die worden bereid met behulp van IMAC als zuiveringsstap. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol Blue (HNB) als een colorimetrische indicator voor metaal CATIE-inhoud in een monsteroplossing en UV-VIS-spectroscopie als middel om de hoeveelheid metaal aanwezig te kwantificeren, in het nanomolair-bereik, gebaseerd op de verandering in het HNB-spectrum bij 647 nm. Hoewel het metaalgehalte in een oplossing historisch is bepaald met behulp van atomische Absorptie spectroscopie of inductief gekoppelde plasma technieken, vereisen deze methoden gespecialiseerde apparatuur en training buiten het bereik van een typisch biochemie laboratorium. De hier voorgestelde methode biedt een eenvoudige en snelle manier voor biochemici om het metaalgehalte van monsters te bepalen met behulp van bestaande apparatuur en kennis, zonder in te boeten op nauwkeurigheid.

Introduction

Sinds de oprichting door Porath en co-workers¹, geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie (iMac) is uitgegroeid tot een methode van keuze om snel te scheiden van eiwitten op basis van hun vermogen om te binden met overgangsmetalen ionen zoals Zn^{2 +}, ni^{2 +}, Cu^{2 +}, en co^{2 +}. Dit wordt meestal gedaan via engineered poly-histidine Tags en is nu een van de meest voorkomende chromatografische zuivering technieken voor de isolatie van recombinant eiwitten². IMac heeft ook toepassingen gevonden die verder gaan dan recombinant-eiwit zuivering als een manier om quinolonen, tetracyclines, aminoglycosiden, macroliden en β-lactams voor voedsel monsteranalyse³ te isoleren en als een stap in het identificeren van bloed-serumeiwit markers voor lever-en pancreaskanker^4,5. Niet verrassend, iMac is ook uitgegroeid tot een methode van keuze voor de isolatie van een aantal inheemse Bioenergetics enzymen^6,7,8,9,10. De succesvolle toepassing van deze zuiverings methoden voor studies op enzymatisch actieve bioenergetische eiwitten is echter afhankelijk van de aanwezigheid van verwaarloosbare metaal kationen uit de kolom matrix in het eluaat. De divalente metaal kationen die gewoonlijk in iMac worden gebruikt, hebben een pathologisch biologisch belang, zelfs bij lage concentraties^11,12. Het fysiologische effect van deze metalen is het meest uitgesproken in bioenergetische systemen, waar ze dodelijk kunnen blijken als remmers van cellulaire ademhaling of fotosynthese^13,14,15. Vergelijkbare problemen zijn onvermijdelijk voor de meerderheid van de eiwit klassen waar rest verontreiniging metalen kunnen interfereren met de biologische functies van een eiwit of karakterisering met biochemische en biofysische technieken.

Terwijl het gehalte aan metaalverontreiniging onder oxiderende omstandigheden en het gebruik van imidazol als eluant doorgaans laag is¹⁶, eiwit isolaties uitgevoerd in de aanwezigheid van cysteïne reducerende agentia (DTT, β-mercaptoethanol, enz.) of met sterkere chelatoren zoals histidine^17,18 of ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) resulteren in veel hogere niveaus van metaalverontreiniging^19,20. Evenzo, aangezien metaalionen in IMAC-harsen vaak worden gecoördineerd door Carbon groepen, hebben eiwit eluties die onder zure omstandigheden worden uitgevoerd waarschijnlijk ook veel hogere niveaus van metaalverontreiniging. Metaalgehalte in oplossingen kan worden beoordeeld met behulp van atomische Absorptie spectroscopie (aas) en inductief gekoppeld plasma-massaspectrometrie (ICP-MS) tot een aantoonbaarheidsgrens in het ppb-ppt-bereik^21,22,23,24. Helaas, AAS en ICP-MS zijn niet realistisch middelen voor detectie in een traditionele biochemie Lab omdat deze methoden toegang tot gespecialiseerde apparatuur en training zou vereisen.

Vorig werk van Brittain^25,26 onderzocht het gebruik van hydroxynaphthol Blue (hnb) als een manier om de aanwezigheid van overgangsmetalen in oplossing te identificeren. Er waren echter verschillende interne contradicties in de data²⁰ en die werken hebben geen adequaat protocol kunnen bieden. Studies van Temel et al.²⁷ en Ferreira et al.²⁸ verbreiden het werk van Brittain met hnb als een potentiële metalen indicator. Echter, Temel ontwikkelde een protocol dat gebruik maakt van AAS voor monsteranalyse, met behulp van HNB alleen als een chelerende agent. De studie van Ferreira gebruikte de verandering in het HNB extinctie Spectra bij 563 nm, een gebied van de Free-Dye HNB spectra die zwaar overlapt met de spectra van HNB-Metal complexen bij pH 5,7, waardoor de gevoeligheid van de assay vrij laag is en ook resulteert in relatief zwakke metaalbinding affiniteit²⁰. Om problemen in ons eigen lab met ni^{2 +} uitspoeling van iMac aan te pakken, hebben we het werk van Brittain^25,26 en Ferreria²⁸ uitgebreid om een eenvoudige assay te ontwikkelen die in staat is om nanomolaire niveaus van verschillende overgangsmetalen te detecteren. We toonden aan dat HNB nikkel bindt en andere vaak voor IMAC-metalen met sub-nanomolaire bindende affiniteiten en Form 1:1 complex over een breed scala aan pH-waarden²⁰. De hier gerapporteerde assay is gebaseerd op deze bevindingen en maakt gebruik van absorptie veranderingen in het HNB-spectrum bij 647 nm voor metaal kwantificering. De test kan worden uitgevoerd in de fysiologische pH-reeks met behulp van gemeenschappelijke buffers en instrumentatie gevonden in een typische biochemie Lab met behulp van colorimetrische detectie en kwantificering van metaal-Dye complexen en de bijbehorende verandering in de extinctie van de vrije-kleurstof wanneer het bindt aan metaal.

Protocol

1. preparaat van de test component Bepaal de chromatografie fracties die moeten worden getest met optische extinctie bij 280 nm of alternatieve methoden voor eiwit kwantificering om de eiwit verrijkte fracties te identificeren.Opmerking: voor dit werk gebruikten we een diode array UV-VIS spectrofotometer. Om de doorvoer te verhogen, kan een plaat lezer worden gebruikt die geschikt is voor het meten van de UV/VIS-extinctie. Bereiding van de noodzakelijke assay componenten Bereid of verkrijg…

Representative Results

Het spectrum van vrije HNB bij neutrale pH (zwarte lijn) en representatieve spectra van fracties die zijn aangevallen voor ni2 + uit de isolatie van MSP1E3D129 zijn weergegeven in Figuur 2. Een succesvolle assay-serie moet een verminderde extinctie vertonen bij 647 nm in vergelijking met de HNB-controle, die overeenkomt met de vorming van HNB-complexen in de aanwezigheid van een overgangsmetaal. Een mislukte test zou worden aangegeven door een toename van d…

Discussion

Colorimetrische detectie van metalen met behulp van HNB biedt een eenvoudige manier om de mate van eiwit verontreiniging te kwantificeren door overgangsmetalen ionen van IMAC-harsen. Zoals we gevestigd in Ref. 20, ni^{2 +} bindt aan hnb met 1:1 Stoichiometrie en de dissociatieconstante voor de ni-hnb complex veranderingen met pH. Het complex K_d bevindt zich echter in het Sub-nm-bereik voor alle aanbevolen (7-12) pH-waarden. Praktisch gezien betekent dit dat alle ni^{2 +} in alle geteste fractie…

Materials

2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media for E.coli growth
HEPES, free acid	BioBasic	HB0264	alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, free acid	BioBasic	MB0360	alternative buffer
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium phosphate	Fisher Scientific	S369-500	alternative buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500