Summary

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

Published: March 10, 2020
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Summary

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Abstract

El sistema de secreción de Punto/Cm de Legionella pneumophila es una nanomáquina compleja del sistema de secreción tipo IV (T4SS) que se localiza en el polo bacteriano y media la entrega de proteínas y sustratos de ADN a las células diana, un proceso que generalmente requiere contacto directo de célula a célula. Recientemente hemos resuelto la estructura del aparato Dot/Icm mediante tomografía crioelectrónica (crio-ET) y hemos demostrado que forma un canal de expansión celular que se conecta a un complejo citoplasmático. La aplicación de dos enfoques complementarios que preservan la estructura nativa de la muestra, la microscopía fluorescente en células vivas y crio-ET, permite la visualización in situ de proteínas y la asimilación de la estequiometría y el momento de producción de cada componente de la máquina en relación con otras subunidades Dot/Icm. Para investigar los requisitos para el posicionamiento polar y caracterizar las características dinámicas asociadas con la biogénesis de la máquina T4SS, hemos fusionado un gen que codifica la proteína fluorescente verde de la supercarpeta a los genes DOT/Icm ATPase en sus posiciones nativas en el cromosoma. El siguiente método integra la microscopía cuantitativa de fluorescencia de células vivas y crio-ET para cuantificar la localización polar, la dinámica y la estructura de estas proteínas en células bacterianas intactas. La aplicación de estos enfoques para el estudio de la Legionella pneumophila T4SS es útil para caracterizar la función del sistema Punto/Icm y se puede adaptar para estudiar una amplia variedad de patógenos bacterianos que utilizan el T4SS u otros tipos de complejos de secreción bacteriana.

Introduction

Legionella pneumophila (L. pneumophila), el agente etiológico de la enfermedad de los legionarios, habita en los reservorios de agua dulce, donde las bacterias se propagan infectando y replicando dentro de los protozoos acuáticos de natación libre. L. pneumophila causa brotes de enfermedades en los seres humanos cuando se produce la inhalación de bacterias aerosolizadas de fuentes de agua potable. En las células infectadas, la subversión de las vías huésped permite a L. pneumophila retrasar la maduración endocítica de la vacuola en la que reside y promover la biogénesis de un compartimento celular que apoya la replicación bacteriana. Este proceso es impulsado por un sistema especializado de secreción IVB de tipo bacteriano (T4BSS) conocido como Dot/Icm y su repertorio de más de 300 proteínas “efectoras” que se trasladan al citosol huésped durante la infección para facilitar la manipulación de las funciones celulares1,2,3,4,5. Los mutantes que carecen de un aparato funcional Dedo/Cm no entregan efectores en el citosol del huésped, son defectuosos para la replicación intracelular y son avirulentes en modelos animales de enfermedad6,7.

Muchas especies bacterianas han desarrollado máquinas multicomponente extremadamente complejas y dinámicas que son necesarias para los procesos de infección. Otros T4BSS como el sistema Dot/Icm también son esenciales para la replicación intracelular de patógenos bacterianos como Coxiella burnetii y Rickettsiella grylli. Aunque el T4BSS está relacionado evolutivamente con los sistemas prototípicos de tipo IVA, que median la transferencia de ADN y pueden ofrecer un repertorio limitado de proteínas de efectores, el sistema Dot/Icm tiene casi el doble de componentes de la máquina y ofrece una amplia variedad de efectores. Presumiblemente, esta expansión en el número de componentes ha permitido que el aparato Dot/Icm acomode e integre nuevos efectores fácilmente8,9.

Recientemente usamos la tomografía crioelectrónica (crio-ET) para resolver la estructura del aparato Dot/Icm in situ y mostramos que forma un canal de expansión celular que se conecta a un complejo citoplasmático. Análisis posterior reveló que el citosólico ATPase DotB se asocia con el sistema Dot/Icm en el polo celular L. pneumophila a través de interacciones con el citosólico ATPase DotO. Hemos descubierto que DotB muestra un movimiento citosólico en la mayoría de las células bacterianas, lo que indica que este ATPase está presente en una población citosólica dinámica, pero también se asocia con los complejos de puntos polares/icm. Además, DotO forma un conjunto hexamerico de dimers DotO asociados con el complejo de membrana interna, y un hexamer DotB se une a la base de este complejo citoplasmático. El conjunto de la energía DotB-DotO crea un canal citoplasmático que dirige la translocación de sustratos a través del T4SS(Figura 1)10.

A pesar de estos avances recientes, poco se sabe sobre cómo funciona el sistema Dot/Icm y cómo cada proteína se ensambla para formar un aparato activo8. Descubrir los circuitos reguladores del Dot/Icm T4SS es fundamental para entender los mecanismos moleculares de las interacciones huésped-patógeno. Por lo tanto, analizamos cómo utilizar la microscopía de células vivas y crio-ET para detectar y caracterizar los componentes esenciales del sistema L. pneumophila Dot/Icm que están etiquetados con la supercarpeta GFP (sfGFP). Mediante la microscopía cuantitativa de fluorescencia, la localización polar de DotB se definirá en un fondo de tipo salvaje o cuando se elimine el sistema de tipo IV. La microscopía de lapso de tiempo se utilizará para cuantificar las diferencias en la localización y la dinámica entre las ATPases citosólicas Dot/Icm.

La aplicación combinada de dos enfoques complementarios como la imagen en vivo y el crio-ET proporciona una ventaja en comparación con otros sistemas in vitro. Ambos métodos se realizan en celdas intactas y preservan el entorno natural del T4BSS, minimizando así la interrupción de la estructura nativa durante la preparación de la muestra. Debido a que la sobreexpresión de proteínas puede afectar a la estequiometría del aparato de secreción, las fusiones sfGFP se devuelven a través del intercambio alélico al cromosoma Legionella para que cada fusión esté codificada en una sola copia y la expresión sea impulsada por el promotor endógeno. La visualización de fusiones codificadas cromosómicamente permite cuantificar el nivel exacto de proteína expresada en un momento dado definido. Cryo-ET también tiene muchas ventajas para determinar la estructura de los sistemas de secreción. La ventaja más notable es que las muestras crio-ET se componen de células intactas congeladas que preservan complejos nativos en el contexto de la arquitectura celular bacteriana. En consecuencia, el crio-ET puede ser preferible a los enfoques de purificación bioquímica, que extraen complejos de membrana y pueden extraer proteínas periféricas del aparato central o modificar la estructura general. Además, el etiquetado de una proteína de interés con una proteína voluminosa como el sfGFP añade una masa que es detectable por crio-ET y puede ayudar a mapear los diferentes subcomplejos del aparato Punto/Cm en la estructura obtenida por crio-ET.

Este enfoque es una poderosa herramienta para descubrir información estructural sobre complejos multimoleculares que se ensamblan en la membrana celular bacteriana. La interpretación de las estructuras dilucidadas utilizando estas técnicas ayudará al campo a entender cómo funcionan los componentes t4BSS, por qué se requieren tantos componentes para la función, cómo interactúan los componentes dentro del complejo más grande y qué funciones estos subensamblajes de ejecución.

Protocol

NOTA: Todos los procedimientos relacionados con el crecimiento, manipulación e imágenes de L. pneumophila deben realizarse en un laboratorio de nivel de seguridad biológica 2 de conformidad con las directrices locales. 1. Inserción de sfGFP en el cromosoma L. pneumophila utilizando el intercambio alélico y la estrategia de doble selección(Figura 2, Figura 3) Clonar en el vector de reemplazo genético …

Representative Results

La recombinación homóloga con doble selección en dos pasos se utilizó para construir la inserción definida de sfGFP. En el primer paso, se realizó el acoplamiento triparental, donde el plásmido conjugado pRK600 (un plásmido IncP) de la cepa auxiliar E. coli MT616 se movilizó a la cepa del donante E. coli con el vector suicida pSR47S que contiene el flanco sfGFP geneado por las dos regiones homólogas, el origen de la orita de transferencia y el gen de la subselección Bacillus subistitulaci…

Discussion

Elaclarar las funciones de los sistemas de secreción bacteriana es clave para una comprensión completa de las interacciones huésped-patógeno. Los sistemas de secreción son máquinas complejas que pueden inyectar proteínas efectoras en las células huésped, y en algunos casos promueven el establecimiento de un nicho subcelular que apoya la replicación bacteriana. El método anterior proporciona nuevas herramientas importantes para el estudio del sistema de secreción de puntos/mic del patógeno bacteriano respirat…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.C. y C.R.R. fueron apoyados por los NIH (R37AI041699 y R21AI130671). D.P., B.H. y J.L fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud (R01AI087946 y R01GM107629).

Materials

10 nm colloidal gold particles Aurion 25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA) Nikon
ACES Sigma-Aldrich A9758
Activated charcoal Sigma-Aldrich C5510
Agaroze GPG/LMP, low melt American bioanalytical AB00981
Bacto dehydrated agar BD 214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera Photometrics
Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL Fisher Scientific AB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh Quantifoil Q225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 216828
K2 Summit camera for cryo-EM GATAN
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352
Microscope cover slides 22×22 mm Fisher Scientific 12-542B
Microscope cover slides 24×50 mm Fisher Scientific 12-545K
Microscope slides 25x75x1 mm Globe Scientific 1380
SlideBook 6.0 Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine Lumencor
Taq 2X Master Mix New England BioLabs M0270
Titan Krios Thermo Fisher Scientific
Yeast Extract BD 212750

References

  1. Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
  2. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
  3. Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
  4. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  5. Isberg, R. R., O’Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
  6. Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
  7. Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires’ Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
  8. Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
  9. Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
  10. Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
  11. Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
  12. Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
  13. Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
  14. Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
  15. Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
  16. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
  17. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
  18. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
  19. Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
  20. Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
  21. Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
  22. Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
  23. Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
  24. Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
  25. Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
  26. Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
  27. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).

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Citer Cet Article
Chetrit, D., Park, D., Hu, B., Liu, J., Roy, C. R. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (157), e60693, doi:10.3791/60693 (2020).

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