हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल के स्तर का परिमाणीकरण
Summary
यह काम भ्रूण प्रसंस्करण और इथेनॉल विश्लेषण के लिए उचित जोखिम विधियों से सिर अंतरिक्ष गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करएक ज़ेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
Abstract
भ्रूण अल्कोहल स्पेक्ट्रम विकार (एफएएसडी) चेहरे के डिस्मॉर्फोनी और न्यूरोलॉजिकल हानि सहित इथेनॉल-प्रेरित विकासात्मक दोषों के अत्यधिक परिवर्तनीय सातत्य का वर्णन करते हैं। एक जटिल विकृति के साथ, FASD हर साल संयुक्त राज्य अमेरिका में पैदा हुए 100 बच्चों में लगभग 1 को प्रभावित करता है। FASD की अत्यधिक चर प्रकृति के कारण, पशु मॉडल इथेनॉल-प्रेरित विकास दोषों की हमारी वर्तमान मशीनी समझ में महत्वपूर्ण साबित हुए हैं। प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या ने इथेनॉल-प्रेरित विकासात्मक दोषों की जांच करने के लिए जेब्राफिश का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया है। जेब्राफिश बाहरी रूप से निषेचित, आनुवंशिक रूप से पथीय, पारदर्शी भ्रूण की बड़ी संख्या का उत्पादन करता है। यह शोधकर्ताओं को कई आनुवंशिक संदर्भों में इथेनॉल एक्सपोजर के समय और खुराक को ठीक से नियंत्रित करने और लाइव इमेजिंग तकनीकों के माध्यम से भ्रूण इथेनॉल एक्सपोजर के प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। यह, आनुवंशिकी और मनुष्यों के साथ विकास दोनों के संरक्षण के उच्च स्तर के साथ संयुक्त, जेब्राफिश को एक शक्तिशाली मॉडल साबित किया है जिसमें इथेनॉल टेराटोजेनिकिटी के मशीनिस्ट आधार का अध्ययन करना है। हालांकि, इथेनॉल एक्सपोजर रेजिस्टेंस विभिन्न जेब्राफिश अध्ययनों के बीच भिन्न हैं, जिसने इन अध्ययनों में जेब्राफिश डेटा की व्याख्या को चकित कर दिया है। यहां हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है।
Introduction
भ्रूण अल्कोहल स्पेक्ट्रम विकार (एफएएसडी) भ्रूण इथेनॉल एक्सपोजर1से जुड़े न्यूरोलॉजिकल हानि और क्रैनियोफेशियल डिस्मोर्फोलोजी की एक विस्तृत सरणी का वर्णन करता है। इथेनॉल एक्सपोजर और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के समय और खुराक सहित कई कारक, FASD2,3की भिन्नता में योगदान करते हैं। मनुष्यों में, इन चरों का जटिल संबंध फाएसडी के एटिजियोलॉजी का अध्ययन और समझबनाता है। पशु मॉडल इथेनॉल टेराटोजेनिकिटी के यंत्रवादी आधार के बारे में हमारी समझ विकसित करने में महत्वपूर्ण साबित हुए हैं। FASD के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार की पशु मॉडल प्रणालियों का उपयोग किया गया है और परिणाम मनुष्यों में एक्सपोजर में पाए जाने वाले परिणामउल्लेखनीय रूप से सुसंगत रहे हैं4. कृंतक मॉडल सिस्टम का उपयोग एफएएसडी के कई पहलुओं की जांच करने के लिए किया जाता है, जिसमें चूहे सबसे आम5,6,7हैं। इस कार्य का अधिकांश हिस्सा विकासात्मक दोषों पर ध्यान केंद्रित कर 8,हालांकि बाद में इथेनॉल के संपर्क में आने से विकासात्मक विसंगतियों के साथ – साथ9को भी दिखाया गया है । इसके अलावा, चूहों की आनुवंशिक क्षमताओं ने एफएएसडी10,11के आनुवंशिक आधार की जांच करने की हमारी क्षमता में काफी सहायता की है। चूहों में इन अध्ययनों से दृढ़ता से पता चलता है कि ध्वनि हेजहोग मार्ग, रेटिनोइक एसिड सिग्नलिंग, सुपरऑक्साइड डिमुटेस, नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथास I, Aldh2 और Fancd28,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,के साथ जीन-इथेनॉल बातचीत कर रहेहैं, 19,20,21. इन अध्ययनों से पता चलता है कि पशु मॉडल FASD और उसके अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
जेब्राफिश इथेनॉल टेराटोजेनेसिस22,23के कई पहलुओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है . उनके बाहरी निषेचन, उच्च फेकंडिटी, आनुवंशिक ट्रैक्टेबिलिटी और लाइव इमेजिंग क्षमताओं के कारण, जेब्राफिश आदर्श रूप से इथेनॉल टेराटोजेनेसिस के समय, खुराक और आनुवंशिकी जैसे कारकों का अध्ययन करने के लिए अनुकूल हैं। इथेनॉल को भ्रूण का ठीक मंचन करने के लिए प्रशासित किया जा सकता है और भ्रूण को विकास प्रक्रियाओं के दौरान इथेनॉल के प्रत्यक्ष प्रभाव की जांच करने के लिए चित्रित किया जा सकता है। यह काम सीधे मनुष्यों से संबंधित हो सकता है, क्योंकि विकास के आनुवंशिक कार्यक्रम जेब्राफिश और मनुष्यों के बीच अत्यधिक संरक्षित हैं और इसलिए24एफएएसडी मानव अध्ययन का मार्गदर्शन करने में मदद कर सकते हैं। जबकि ज़ेब्राफिश का उपयोग इथेनॉल टेराटोजेनेसिस की जांच करने के लिए किया गया है, भ्रूण इथेनॉल सांद्रता की रिपोर्टकरने में आम सहमति की कमी मनुष्यों की तुलनामुश्किल 25बनाती है। स्तनधारी प्रणालियों में, रक्त-अल्कोहल का स्तर ऊतक इथेनॉल स्तर26से सीधे संबंधित है। जेब्राफिश अध्ययन के कई अपने संचार प्रणाली के पूर्ण गठन से पहले भ्रूण का इलाज। जांच करने के लिए कोई मातृ नमूना के साथ, भ्रूण के भीतर इथेनॉल के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए इथेनॉल सांद्रता का आकलन करने की प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। यहां हम हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके एक विकासशील जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक विकासात्मक मॉडल प्रणाली के रूप में, जेब्राफिश विकास पर पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल हैं। वे बाहरी रूप से निषेचित भ्रूण की बड़ी संख्या का उत्पादन करते हैं, जो …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस लेख में प्रस्तुत शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान/नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनिओफेशियल रिसर्च (एनआईएच/एनआईडीसीआर) R01DE020884 से जेकेई को पिछले अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था । और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान/शराब के दुरुपयोग और शराब पर राष्ट्रीय संस्थान (NIH/NIAAA) F32AA021320 C.B.L. और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से वर्तमान अनुदान/शराब के दुरुपयोग पर राष्ट्रीय संस्थान (NIH/NIAAA) R00AA023560 से C.B.L. हम गैस क्रोमेटोग्राफ विश्लेषण प्रदान करने और सहायता करने के लिए रुएबेन गोंजालेस को धन्यवाद देते हैं। हम तियाहना ओंटिवरोस और डॉ जीना नोबल्स लेखन सहायता का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
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