Quantificazione dei livelli di etanolo negli embrioni di pesce zebra utilizzando la cromatografia dello spazio della testa
Summary
Questo lavoro descrive un protocollo per quantificare i livelli di etanolo in un embrione di pesce zebra utilizzando la cromatografia del gas dello spazio della testa da metodi di esposizione adeguati alla lavorazione degli embrioni e all’analisi dell’etanolo.
Abstract
I disturbi dello spettro dell’alcolfe fetale (FASD) descrivono un continuum altamente variabile di difetti dello sviluppo indotti dall’etanolo, tra cui dismofomorfologie facciali e disturbi neurologici. Con una patologia complessa, FASD colpisce circa 1 bambino su 100 nati negli Stati Uniti ogni anno. A causa della natura altamente variabile della FASD, i modelli animali si sono dimostrati critici nella nostra attuale comprensione meccanicistica dei difetti di sviluppo indotti dall’etanolo. Un numero crescente di laboratori si è concentrato sull’utilizzo del pesce zebra per esaminare i difetti dello sviluppo indotti dall’etanolo. I pesci zebra producono un gran numero di embrioni emblari traslucidi, geneticamente trattivi, che sono esportati esternamente. Ciò consente ai ricercatori di controllare con precisione la tempistica e il dosaggio dell’esposizione all’etanolo in più contesti genetici e di quantificare l’impatto dell’esposizione all’etanolo embrionale attraverso tecniche di imaging dal vivo. Questo, combinato con l’elevato grado di conservazione della genetica e dello sviluppo con gli esseri umani, ha dimostrato che il pesce zebra è un modello potente in cui studiare la base meccanicistica della teratogenicità dell’etanolo. Tuttavia, i regimi di esposizione all’etanolo hanno variato tra diversi studi sui pesci zebra, il che ha confuso l’interpretazione dei dati dei pesci zebra in questi studi. Ecco un protocollo per quantificare le concentrazioni di etanolo negli embrioni di pesce zebra utilizzando la cromatografia del gas dello spazio della testa.
Introduction
I disturbi dello spettro dell’alcolfe fetale (FASD) descrivono una vasta gamma di menomazioni neurologiche e dismorfologie craniofacciali associate all’esposizione all’etanolo embrionale1. Molteplici fattori, tra cui la tempistica e il dosaggio dell’esposizione all’etanolo e il background genetico, contribuiscono alla variazione del FASD2,3. Nell’uomo, la complessa relazione di queste variabili rende difficile lo studio e la comprensione dell’eziologia della FASD. I modelli animali si sono dimostrati cruciali nello sviluppo della nostra comprensione della base meccanicistica della teratogenicità dell’etanolo. Un’ampia varietà di sistemi di modelli animali è stata utilizzata per studiare molteplici aspetti della FASD e i risultati sono stati notevolmente coerenti con quanto si trova nell’esposizionenell’uomo 4. I sistemi modello Roditori sono utilizzati per esaminare molti aspetti del FASD, con i topi che sono i più comuni5,6,7. La maggior parte di questo lavoro si è concentrata sui difetti dello sviluppo per l’esposizione precoce all’etanolo8, anche se in seguito l’esposizione all’etanolo ha dimostrato di causare anomalie dello sviluppo pure9. Inoltre, le capacità genetiche dei topi hanno notevolmente aiutato nella nostra capacità di sondare le basi genetiche di FASD10,11. Questi studi sui topi suggeriscono fortemente che ci sono interazioni gene-etanolo con il percorso riccio sonoro, segnalazione dell’acido retinoico, dismutasi Superossido, sintesi di ossido nitrico I, Aldh2 e Fancd28,10,11, 12,13,14,15,16,17,18 19,20,21. Questi studi dimostrano che i modelli animali sono fondamentali per far progredire la nostra comprensione della FASD e dei suoi meccanismi sottostanti.
Il pesce zebra è emerso come un potente sistema modello per esaminare molti aspetti della teratogenesi dell’etanolo22,23. A causa della loro fecondazione esterna, dell’elevata fecondità, della trattatibilità genetica e delle capacità di imaging dal vivo, i pesci zebra sono ideali per studiare fattori come tempismo, dosaggio e genetica della teratogenesi dell’etanolo. L’etanolo può essere somministrato a embrioni messi in scena con precisione e gli embrioni possono quindi essere immagine per esaminare l’impatto diretto dell’etanolo durante i processi di sviluppo. Questo lavoro può essere correlato direttamente agli esseri umani, perché i programmi genetici di sviluppo sono altamente conservati tra il pesce zebra e gli esseri umani e può quindi aiutare a guidare gli studi umani FASD24. Mentre il pesce zebra è stato utilizzato per esaminare la teratogenesi dell’etanolo, la mancanza di consenso nel segnalare concentrazioni di etanolo embrionale rende difficile il confronto con gli esseri umani25. Nei sistemi dei mammiferi, i livelli di alcol nel sangue sono correlati direttamente ai livelli di etanolo tissutale26. Molti degli studi sui pesci zebra trattano gli embrioni prima della formazione completa del loro sistema circolatorio. Senza un campione materno da esaminare, è necessario un processo per valutare le concentrazioni di etanolo per quantificare i livelli di etanolo all’interno dell’embrione. Qui descriviamo un processo per quantificare le concentrazioni di etanolo in un embrione di pesce zebra in via di sviluppo utilizzando la cromatografia del gas dello spazio della testa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come sistema di modelli di sviluppo, il pesce zebra è ideale per studiare l’impatto dei fattori ambientali sullo sviluppo. Producono un gran numero di embrioni fecondati esternamente, il che consente di tempistica precisa e paradigmi di dosaggio negli studi sull’etanolo. Questo, combinato con le capacità di imaging dal vivo e la conservazione genetica e dello sviluppo con gli esseri umani, rende il pesce zebra un potente sistema modello per gli studi di teratologia. Descritto è un protocollo per misurare le concentraz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca presentata in questo articolo è stata supportata da precedenti sovvenzioni da National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 a J.K.E. e National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 a C.B.L. e con l’attuale sovvenzione da parte dei National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 a C.B.L. Ringraziamo Rueben Gonzales per aver fornito e assistito l’analisi del cromatografo a gas. Ringraziamo Tiahna Ontiveros e la dott.ssa Gina Nobles a scrivere assistenza.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
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